[发明专利]一种番茄基因组总DNA提取试剂盒及其提取方法

权利要求书

1.番茄基因组总DNA提取试剂盒，其特征在于，包括以下试剂：

(1)1M Tris-HCl(pH8.0)：称取Tris·base 12.114g，用少量蒸馏水加热溶解，溶解后用浓盐酸调节pH＝8.0，最后加水定容至100mL，121℃ 25min高压灭菌；

(2)0.25M EDTA(pH8.0)：称取EDTA钠盐9.305g，加少量蒸馏水溶解后，用NaOH调至pH＝8.0，最后加水定容至100mL，121℃ 25min高压灭菌；

(3)2.5M NaCl：称取14.625g Nacl，加蒸馏水溶解后定容至100mL；

(4)TE(pH8.0)溶液：量取前面灭过菌的1M Tris-HCl(pH8.0)1mL，0.25MEDTA(pH8.0)0.4mL，加水定容至100mL备用；

(5)Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)：量取50mL Tris饱和酚，48ml氯仿和2mL异戊醇，混匀即可；

(6)氯仿∶异戊醇(24∶1)：量取96ml氯仿和4mL异戊醇，混匀即可；

(7)70％乙醇：量取70mL无水乙醇，加水定容至100mL；

(8)3M乙酸钠(PH＝5.2)：称量40.8gNaAC·3H2O于100ml烧杯中，加入约40ml的蒸馏水搅拌溶解，加入冰醋酸调节PH值至5.2，蒸馏水定容至100ml，121℃ 25min高压灭菌；

(9)无水乙醇；

(10)2×CTAB提取液；

(11)β-巯基乙醇；

(12)异丙醇。

2.应用权利要求1所述试剂盒进行番茄基因组总DNA提取的方法，其特征在于，按照以下步骤进行：(1)样品的采集与研磨：采摘番茄植株上10片长宽约1cm的幼嫩叶片，装入2ml的离心管，加满液氮后置于预冷的离心管架上迅速用研磨棒研磨至粉末状；(2)粗提DNA：加65℃的2×CTAB提取液900ul和30ul的β-巯基乙醇，混合均匀后65℃水浴60min，每隔5min上下颠倒混匀一次；(3)抽提DNA：取出离心管放冰上冷却10min，加4℃预冷的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提一次，加4℃预冷的氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提2次，转移上清至1.5ml的离心管；(4)沉淀与洗涤DNA：加4℃预冷的异丙醇溶液和醋酸钠溶液，放-20℃下沉淀3h，4℃ 14000rpm离心10min，弃上清，加70％的乙醇溶液洗涤沉淀2次，加无水乙醇溶液洗涤沉淀1次，通风橱内风干后加TE溶液溶解沉淀；(5)纯化DNA：向管内加RNAase，37℃水浴60min，加4℃预冷的Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液抽提1次，加氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液抽提2次，转移上清至新1.5ml离心管；(6)沉淀、洗涤、溶解DNA样品：加4℃预冷的异丙醇溶液和醋酸钠溶液，放-20℃冰箱中沉淀3h，4℃ 14000rpm离心10min，弃上清，加70％的乙醇溶液洗涤沉淀2次，加无水乙醇溶液洗涤沉淀1次，通风橱内风干，加TE溶液溶解沉淀，放-20℃下长期保存。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中所采摘的番茄幼嫩叶片为番茄生长侧枝上的叶片，叶片应依次放入离心管，相互之间不能挤压。

4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(2)中的2×CTAB提取液，每100ml 2×CTAB提取液由10％的CTAB(W/V)溶液20ml、1M Tris-HCl(pH＝8.0)溶液10ml、0.25M EDTA(pH＝8.0)溶液8ml、0.25M NaCl溶液56ml，双蒸水6ml组成。

5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)中所加Tris饱和酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)溶液为900ul进行1次抽提，所加氯仿∶异戊醇(24∶1)溶液的体积与第一次抽提后所取上清体积相同，每次所取上清体积和所加溶液体积为800ul～850ul。

6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(4)中所加异丙醇溶液为700ul，3M乙酸钠溶液为70ul，所加70％乙醇溶液、无水乙醇溶液和TE溶液均为200ul，每100mlTE溶液由1M Tris-HCl(pH＝8.0)1mL，0.25M EDTA(pH＝8.0)0.4mL，双蒸水98.6mL配制而成。