[发明专利]乙型肝炎病毒基因分型的基因芯片和试剂盒及方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因分型检测的基因芯片和试剂盒及其方法，可用于人乙型肝炎病毒(HBV)基因型(B、C、D)三型感染的辅助诊断。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是主要的肝脏疾病致病因子。世界上有20亿人感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人已近50万。估计全球每年有100-200万人直接死于HBV持续感染。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，是一种DNA病毒，其基因组由长3.2kb的部分双链DNA组成，共有四个开放读码框(Open Readin Frame，ORF)：S、C、P、X，他们编码至少8个不同蛋白：表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒复制产量高(1012-13病毒粒/天)和突变率高(1010-11个点突变/天)的特征，高突变是由于高复制，尤其是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。根据HBV全基因核苷酸序列异源性大于8％或S基因区核苷酸序列异源性大于4.1％，可将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H，8个基因型。

HBV基因型呈一定的地域性分布：在世界不同地区基因型分布不同，A型为全世界分布，B型、C型主要分布在亚洲，D型分布在南欧、美、澳大利亚和中东，E型分布在非洲，F型分布在美洲土著人和波利尼西亚，G型分布在美洲、欧洲，H型在美国发现。目前我国乙型肝炎患者的HBV基因型主要是B、C和D这三型，并以C型最多，其中在北方城市以C型为主，由北方至南方，B型感染率逐渐增高，在香港、广州等南部地区有少部分D型分布，另外，华北、新疆地区有A型存在。

众多的研究证实，不同基因型的乙肝病毒具有不同的致病性，人类感染乙肝病毒后的临床病情轻重、肝脏病变程度以及治疗效应与乙肝病毒的基因型存在着十分密切的关系。A型乙肝病毒的抗原性可能较弱，故免疫清除能力较弱，不过有报道指出A型乙肝病毒对标准干扰素治疗的应答率较其他基因型高；B型乙肝病毒则与慢性携带有关，并且年轻患者容易发展成肝细胞癌症；由于较容易发生CP变异和在迁延性感染时免疫清除期较长，C型乙肝病毒导致的肝脏炎症损害和纤维化较其他基因型严重；而D型乙肝病毒多见于重度肝炎。因此，对乙肝患者进行乙肝病毒分型测定，有助于患者早期治疗和指导临床医生制定针对性的治疗方案以及预后判断。

目前多采用基因型特异性引物PCR法、限制性片段长度多态性分析法(RFLP)和基因序列测定法对HBV进行基因分型检测。

基因型特异性引物PCR法通常需要借助凝胶电泳判读结果，这种受到很多不可确定性因素制约的结果判读方法一直避免应用于临床检测，所以此法目前多限于科学研究领域。

RFLP操作繁琐而且重复性差，对检测人员技术要求较高，使得其无法在临床上得到广泛应用。

基因序列测定法是最准确可靠的方法，但是测序需要的设备和技术门槛使得测序只能局限在某些具有一定实力的单位进行，国家相关机构也无法对不同检测对象的测序结果进行质量控制，再加上测序费用较高，使得基因测序根本无法应用于临床检测。

目前，市场上仅有的两种乙肝病毒基因分型检测试剂盒都是采用PCR荧光法，但由于荧光染料和检测仪器的局限性，这两种分型试剂盒仅能对B型和C型进行分型。

1989年由Saiki等提出了反向斑点杂交(reverse dot blot，RDB)技术，该技术是在PCR技术的基础上进行了一个实用性的改进。Saiki及其同事在检测HLA时提出了一个有效的改进，该方法是将靶基因在PCR过程用放射性元素标记，然后与尼龙膜杂交，从而检测靶基因的突变情况。这一方法可将多个靶基因在同一条件下进行检测从而大大提高了检测的效率。随后，其它科学家证实了该方法可以区分单个碱基的突变，利用共价键的探针固定方法代替紫外交联以及使用非放射性的生物素标记引物的方法，RDB技术的稳定性有了明显的提高。目前Inogenetics的LiPA系列产品(通过CE认证)均是基于上述的原理。