[发明专利]一种小麦组织活性氧荧光标记方法

说明书

技术领域

本发明属于植物逆境胁迫与生理响应技术领域，涉及一种植物组织活性氧定位及相对含量检测的荧光标记方法，特别涉及一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。

背景技术

植物在生长发育过程中时时遭受各种逆境以及不可避免的衰老过程，从而造成植物细胞活性氧（reactive oxygen species）代谢失调，即植物体内活性氧如超氧物阴离子（OH·^-），过氧化氢（H₂O₂）、羟基自由基（-OH）、单线态氧（¹O_2）等猝发；而活性氧的清除剂，如超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）、类胡萝卜素、维生素E、维生素C等生物合成或活性水平下降，导致活性氧产生与清除动态平衡紊乱，活性氧积累。活性氧积累对植物产生伤害的一个重要机制是直接或间接启动膜脂的过氧化作用，导致细胞膜、类囊体片层结构、线粒体膜、核膜等细胞膜系统损伤、降解，丙二醛（MDA）含量增加，叶绿素降解和光合作用酶活性下降，植物光合效率下降，植物不能维持正常的生长和发育，组织过早衰老死亡。

小麦是两年生作物，在整个生活史中要遭受冬季冻害、春季干旱、初夏热害等自然逆境，以及病虫害等生物逆境，同时花后灌浆过程又是一个不可避免的衰老过程。因此，检测小麦组织活性氧产生部位与含量是衡量小麦抗逆性、高产稳产的一个关键指标，是育种学家筛选优良小麦品种的一个重要措施。以前的文献中，对活性氧的标记一般用硝基四氮唑蓝（NBT）标记超氧物阴离子（活性氧中的一种），3,3'-二氨基联苯胺（DAB）标记H₂O₂活性氧中的一种）。然而，植物组织中活性氧种类繁多，其产生量也相差很大，因此，难以用1-2种活性氧含量的变化说明植物的抗逆性或衰老进程。更重要的是，目前对小麦组织、特别是较大体积的材料中活性氧综合产生量还没有科学的检测方法。

2’, 7’-二氯氢化荧光素双乙酸酯（DCFH-DA）可以通过细胞膜进入细胞内，被细胞内非特异性脂酶催化生成2’, 7’-二氢二氯荧光黄（DCFH），DCFH不能发出荧光。当细胞内有活性氧存在时，DCFH可以被氧化成2’, 7’-二氯荧光黄（DCF），在488 nm波长激光激发下发出波长530 nm左右的绿色荧光。DCF形成量与细胞氧化产物水平呈正比。因此，DCF荧光强度间接反映细胞内活性氧的综合水平（Schopfer et al., 2001）。DCFH-DA标记活性氧首先在动物细胞上应用，在植物上的应用还只限于如悬浮培养细胞、菌类、原生质体等单个细胞或体积很小的材料，如剥离的叶片表皮层细胞。

本发明应用DCFH-DA荧光标记，首先在小麦叶片、茎秆等较大组织材料中标记活性氧的产生、定位及相对含量的检测，最大限度保留细胞活性、对小麦植株内产生的活性氧进行精准标记。

发明内容

为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种小麦生长发育过程中遭受生物逆境与非生物逆境胁迫下活性氧的产生、产生部位与相对含量的标记方法。

本发明提供了一种活性氧荧光标方法，采用DCFH-DA对小麦不同组织材料中的活性氧进行综合标记、定位及相对含量检测。

该方法包括下述的步骤：

a. 配制小麦组织样品标记负载缓冲液，吸取样品标记负载缓冲液5 ml置入容积6-10ml的器皿中；

以上的标记负载缓冲液通过如下方法配制：

配制10 mM Tris-HCl或磷酸盐（PBS）缓冲液（pH 7.2-7.5）；用DMSO、醇溶液配制DCFH-DA母液（可冻存于?20℃-?80℃条件下），浓度为3-5 mM；用缓冲液配制荧光标记负载液，含最终浓度为30-50 μM的DCFH-DA、终浓度为50 mM的KCl和终浓度为2.2-2.8%（体积百分比）的戊二醛。

b. 用锋利刀片，如剃须刀片或手术刀片，将小麦茎秆、叶片等材料切割成长度为0.5 cm组织块；

c. 用样品标记负载缓冲液漂洗步骤b制得组织块，至少漂洗两次，然后将组织块置于步骤a中盛有标记负载缓冲液的器皿中，密封后抽气，使植物组织块全部沉到器皿底部，促使负载缓冲液快速进入材料内部；

d. 在25℃下避光放置20-30分钟；