[发明专利]特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacterium carotovorum，异名Erwinia carotovora)的检测方法，具体涉及一种特异性检测植物软腐病中此菌的PCR(聚合酶链式反应)技术。

背景技术

植物软腐病是一类重要的植物病害，可以由真菌引起，也可由细菌引起。同一种植物的腐烂病可以由果胶杆菌属不同种的细菌引起，如马铃薯可以受到3种果胶杆菌即胡萝卜软腐果胶杆菌Pectobacterium carotovorum、马铃薯黑胫病菌Pectobacterium atrosepticum(异名Pectobacterium carotovorum var.atrosepticum，Erwinia carotovora subsp.atroseptica)、和菊欧氏菌Pectobacterium chrysanthemi(异名Erwinia chrysanthemi)的危害，因此造成了病原鉴定的困难。曾有人介绍过马铃薯种薯中上述3种菌的常规鉴定方法，即分离病菌后通过革兰氏染色、氧化酶试验、葡萄糖发酵、利用α-甲基-D-葡萄糖、37℃和39℃生长、蔗糖代谢产物的形成、磷酸酶的产生、红霉素敏感性、吲哚的产生、血清反应、组织浸解试验、及致病性检验进行鉴定的方法。这种方法太过于复杂、耗时。

鉴定细菌种属的分子检测技术一般是用细菌16S rDNA通用引物做PCR，然后将PCR产物测序后在NCBI网站做BLAST，根据最接近PCR产物序列的已经报告的序列来判断待测细菌的归属。不过，果胶杆菌属不同种的16S rDNA序列非常相近，以致于无法准确作出决断。本发明人亦曾试图依据已经报告的果胶杆菌16SrDNA序列来设计特异性PCR引物，结果未能成功找到特异性好的备选序列。鉴于果胶杆菌造成软腐症状的原因是产生果胶酶，为此对果胶杆菌的果胶酶基因做了尝试，以便为准确鉴定软腐细菌提供依据。

发明内容

本发明所要解决技术问题是：针对上述现有技术的不足，提供一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，解决了根据16S rDNA序列鉴定果胶杆菌属细菌特异性不好的问题，可以准确地判断植物软腐病是否由胡萝卜软腐果胶杆菌引起。

为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：一种特异性检测胡萝卜软腐果胶杆菌的PCR方法，该方法是以胡萝卜软腐果胶杆菌果胶裂解酶基因特异性引物对待测样品进行PCR扩增，最后电泳鉴定。该特异性引物为：

正向引物：5’-CTATAGCGGTAATGAAG-3’(如SEQ ID No：1所示)，

反向引物：5’-TTACCGACGCCAGCATAG-3’(如SEQ ID No：2所示)。

对本发明详述如下：

一、引物的设计：

发明人利用胡萝卜软腐果胶杆菌种间果胶酶基因核苷酸序列的特异性，从NCBI/GenBank搜索并下载了胡萝卜软腐果胶杆菌的果胶酶基因碱基序列，用这些序列分别做BLAST，结果表明登录号为L32171.1的胡萝卜软腐果胶杆菌果胶裂解酶基因的碱基序列的特异性比较好，见图1。

依据登录号为L32171.1的碱基序列，用primerBLAST工具设计PCR引物序列如下：

正向引物：5’-CTATAGCGGTAATGAAG-3’，

反向引物：5’-TTACCGACGCCAGCATAG-3’，

上述引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。PCR产物预计大小约为861bp。

将正向引物和反向引物分别经BLAST检索，见图2和图3。结果表明：该正向引物BLAST得到的序列排在前面的6个序列和反向引物BLAST得到的序列排在前面的3个序列全是胡萝卜软腐果胶杆菌的序列。

二、PCR过程：

细菌基因组DNA的提取：取胡萝卜果胶杆菌胡萝卜亚种PCC1000菌系细菌在常用的肉汁胨细菌培养基上28℃培养20-30h，得到单菌落，用无菌牙签挑取单菌落，洗入10μl ddH2O中，99℃处理10min，离心后收集上清液，置于冰上备用。

用上述设计的引物对对细菌总DNA进行扩增，预计扩增片段约为861bp。

果胶酶基因扩增条件：预变性94℃ 5min；循环参数：94℃ 30sec；65℃30sec；72℃ 60sec；共30个循环；72℃ 10min延伸。

三、PCR扩增产物的鉴定：