[发明专利]凝胶电泳核酸标志物及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种非变性聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)电泳核酸标志物，尤其涉及一种可用于分析、分离小分子核酸PAGE电泳的核酸标志物、及其制备方法和应用。

背景技术

凝胶电泳（Gel electrophoresis）是用于分离和分析不同物理性质的分子的一类技术，该方法操作简便快捷，可以分辨其它方法不能分类的DNA、RNA片段，因此被广泛应用于分子生物学、遗传学和生物化学，通过检测出的不同条带，即可确定核酸的位置，进行进一步分析或回收。

核酸的凝胶电泳一般采用琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶（PAGE），其中，聚丙烯酰胺凝胶具有较高的分辨率，能有效分离相差1nt的核酸分子，因此，对于小分子（≤200nt）核酸的电泳，一般采用聚丙烯酰胺凝胶。

目前用作小分子（<100nt）核酸电泳的分子对照物（标志物）很少，并且大多为单链RNA。由于RNA酶无处不在，并且难以灭活，通常在操作前需要对所用器材进行严格处理，对操作者技术要求较高，大大限制了RNA分子标志物的应用。而不含变性剂（如尿素、甲酰胺等）的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离100nt以下片段RNA、尤其是20nt左右微小RNA（miRNA），尚缺乏有效的分子标志物。

通过液相杂交然后非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，可用于小分子核酸的检测，该方法建立在传统Northern Blot技术核心上，能有效检测样品内非编码小RNA的表达量，具有简便、经济、快速、可靠等特点。然而要获得准确可靠的结果，必须有非变性聚丙烯酰胺电泳相对应的分子标志物作参照。

因此，需要探索用于非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离更为稳定、可靠的核酸分子标志物。

发明内容

针对小分子核酸凝胶电泳分子标志物缺乏、以及实用性受限的缺陷，本发明提供了一种新型小分子核酸标志物，用于液相杂交后非变性PAGE凝胶电泳分子对照，尤其适用于对<200bp核酸的检测。

本发明第一个目的是提供一种核酸电泳的分子标志物，包括：包括单链DNA，还包括DNA-DNA双链和/或DNA-RNA杂化双链。DNA-DNA双链中的两个单链DNA碱基数目相同并且互补，同样地，DNA-RNA双链中的单链DNA和单链RNA碱基数目相同并且互补。

其中，所述DNA-RNA杂化链中单链RNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进一步优选为21和40nt的序列；所述单链DNA、DNA-DNA双链和DNA-RNA杂化链中单链DNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进一步优选为21和40nt的序列。

本发明上述的非变性PAGE电泳核酸标志物的一种优选实施方式，其中，单链DNA和单链RNA中同一碱基连续不超过4个。

其中，单链DNA和单链RNA中A、G碱基占碱基总数量的百分比≤60%。

本发明上述的非变性PAGE电泳的核酸标志物，单链DNA和/或单链RNA的3′端标记非同位素（生物素）。

本发明第二个目的是提供一种上述非变性PAGE电泳核酸标志物的制备方法，根据待测样品来源和探针类型，设计合成DNA单链及其互补单链DNA序列，RNA单链及其互补的DNA单链；DNA单链及其互补单链DNA序列，RNA单链及其互补的DNA单链通过液相杂交按照碱基互补配对原则分别形成DNA-DNA杂化链和/或DNA-RNA双链。

其中，所述单链RNA和单链DNA优选为10nt、21nt、40nt、88nt的序列，进一步优选为21nt和40nt的序列；如10nt、21nt、40nt、88nt等不同大小序列。例如：

10ntDNA序列（5′-3′）：

atgtagagct                                              SEQ ID No.1

10ntDNA互补序列（5′-3′）：

agctctacat                                              SEQ ID No.2

21ntDNA序列（5′-3′）：

acccagtagccagatgtagct                                   SEQ ID No.3

21ntDNA互补序列（5′-3′）：

agctacatctggctactgggt                                    SEQ ID No.4