[发明专利]一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用

权利要求书

1.一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，重组腺病毒载体Ad5 E1A中的24bp碱基缺失，该类型重组腺病毒载体可以在pRB null/mutant的肿瘤细胞中特异性复制；采用同源重组的方法将Ad5腺病毒基因组位于Hexon上第21468bp～21573bp的BamHI进行突变；在Ad5腺病毒基因组第31042bp处插入的修饰纤维蛋白为5/3，5/6，5/7，5/11，5/35序列中的任意一个；在Ad5腺病毒基因组fiber和E4之间即在Ad5腺病毒基因组第32788bp～32913bp处引入两个单一的酶切位点BamHI、SfuI，在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入一个用于筛选的表达元件；在Ad5腺病毒基因组引入的两个单一酶切位点之间插入双向表达框，该双向表达框携带一个报告基因和一个治疗基因，得到携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体。

2.如权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所说的24bp碱基缺失的位置在腺病毒基因组的第922bp～947bp，碱基缺失序列为cttacctgccacgaggctggcttt。

3.如权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所述的筛选的表达元件是用于蓝白斑筛选的β-半乳糖苷酶基因表达元件，即在细菌中表达的用于筛选的荧光蛋白表达元件、氨苄青霉素表达元件、卡那霉素表达元件、氯霉素表达元件中的任意一种。

4.如权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所述携带的报告基因是绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、荧光素酶、β-半乳糖苷酶基因中的任意一种。

5.如权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所述携带的治疗基因是TRAIL，IL-24，IL-12，IFN，p53，arresten，endostatin中的任意一种。

6.权利要求1所述的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体一步法构建方法，其特征在于，具体按下述步骤构建：

(1)用酶切连接的方法构建Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的穿梭载体：

以Ad5基因组质粒为模板，经过重叠聚合酶链式反应获得含有Ad5 E1A分子中24bp碱基缺失的基因片段；将聚合酶链式反应片段与pGEMT-T easy载体连接，将连接产物转化DH5α细胞，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，将所获得阳性克隆命名为pGEMT/Ad5-D24F；

将Ad5-D24F片段从pGEMT/Ad5-D24F上经PacI和SpeI双酶切下来，与用PacI和SpeI双酶切处理的腺病毒E1穿梭载体(AdEasy vector pShuttle)进行连接，连接产物转化DH5α细胞、提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pHBD24 shuttle，此载体为获得的pAd5 E1A 24bp缺失的穿梭载体；

(2)构建pHBD24-backbone：

将ScaI线性化的pHBD24 shuttle穿梭载体与ClaI线性化腺病毒骨架载体pTG3602/SwaI按摩尔比3∶1配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为Ad5 E1A分子中24个碱基缺失的腺病毒载体骨架，命名为pHBD24-backbone；

(3)构建定点突变六联体蛋白高可变区5中的BamHI位点的pHBD24-backbone：

以腺病毒Ad5基因组为模板，通过PCR的方法获得六联体蛋白高可变区5序列下游2300bp的同源臂序列，连于pGEM-T easy载体上，获得pGEMT/Hexon HR down-1；

以pGEMT/Hexon HR down-1为模板，采用PCR反应定点突变六联体蛋白高可变区5下游同源臂序列中的BamHI位点，获得的阳性克隆命名为pGEMT/Hexon BM；

将SwaI线性化的pHBD24-backbone和pGEMT/Hexon BM按摩尔比1∶6配制，共转化感受态细胞BJ5183，经碱性裂解法提取质粒DNA，经酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得的阳性克隆即为pHBD24BM；

(4)构建引入单一酶切位点BmaHI的腺病毒纤维蛋白修饰序列的3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：

以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5纤维蛋白修饰的5’端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点BamHI的腺病毒纤维蛋白序列5’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/fiber up-BamHI；合成Ad5的Tail以及纤维蛋白嵌合体的Shaft和Knob序列，在Ad5的Tail序列上含有NdeI位点，在纤维蛋白修饰序列的Knob 3’端引入SpeI位点，通过NdeI和SpeI双酶切，将此序列克隆到pshuttle Ad5-E4-fiber载体的相应的酶切位点中，所获得的新载体称为pGEMT/fiber chimeric up BamHI；

(5)构建引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体：

以腺病毒Ad5基因组DNA为模板，通过PCR扩增获得引入单一酶切位点的Ad5 E4区3’端上游2.0kb的片段，反应扩增产物经质量浓度为1％的琼脂糖凝胶电泳后回收片段；将回收的聚合酶链式反应产物分别与pGEMT-easy载体连接，经碱性裂解法提取质粒DNA，通过酶切及测序鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点SfuI的腺病毒E4序列3’上游2.0kb同源臂的质粒载体，命名为pGEMT/E4up-SfuI；

(6)构建腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体：

以pUC19载体为基础，在氨苄抗性基因的开放读码框的两端通过基因突变的方式产生两个单一的酶切位点XbaI及SfuI，然后将卡那抗性基因克隆到XbaI和SfuI的位点中，所获得的卡那抗性载体与EcoRI-HindIII linker连接，获得的载体命名为pUCKanEHL；

将fiber up和E4up分别从pGEMT/fiber chimeric up BamHI和pGEMT/E4 up-SfuI上经对应的内切酶双酶切下来，再依次连入pUCKanEHL，经碱性裂解法提取质粒DNA、酶切鉴定，获得阳性克隆，命名为pshuttle-fiber-E4HR；

将经过单一酶切位点BamHI和SfuI所对应的内切酶双酶切的筛选表达元件连入经过相同酶双酶切的pshuttle-fiber chimeric-E4HR载体，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆为腺病毒fiber-E4部位携带筛选基因的穿梭载体，命名为pshuttle-fiber chimeric-E4/screening gene；

(7)构建引入单一酶切位点的Ad5D24条件复制型腺病毒载体：

将pshuttle-fiber chimeric-E4/screening gene与pHBD24BM分别通过PacI与SwaI酶切线性化后，按摩尔比6∶1配制共转化BJ5183感受态细胞，提取质粒DNA、酶切鉴定获得阳性克隆为引入单一酶切位点的Ad5D24条件复制型腺病毒载体，命名为pHBD24-fiber chimeric-BS；

(8)构建携带外源基因的穿梭载体：

通过聚合酶链式反应方法扩增miniCMV-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/miniCMV-SV40；

同样扩增PGK-SV40表达元件，将产物与pGEMT-T easy载体连接，通过酶切及测序鉴定阳性克隆，所获得阳性克隆命名为pGEMT/PGK-SV40；

将miniCMV-SV40片段与PGK-SV40片段分别从pGEMT/miniCMV-SV40和pGEMT/PGK-SV40上经相应酶切位点双酶切下来，与经同样酶切的pUCKanEHL进行连接，连接产物采用同样的方法转化，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-PGK-miniCMV；然后分别在miniCMV-SV40表达框中连入报告基因以及在PGK-SV40表达框中连入治疗基因，提取质粒DNA，酶切鉴定获得阳性克隆，命名为pshuttle-BS-治疗基因/报告基因；

(9)携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体的构建及病毒制备：

将构建好的pshuttle-BS-治疗基因/报告基因与pHBD24-fiber chimeric-BS经BamHI和SfuI酶切处理后连接，连接产物转化、培养、筛选，经摇菌、提取质粒DNA、酶切及测序鉴定获得阳性克隆为携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒，命名为pHBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因；

将pHBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因载体经PacI线性化后转染HEK293细胞，7-10天后获得病毒原液，经过扩增，通过CsCl梯度离心纯化后获得携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，命名为HBD24-fiber chimeric-治疗基因/报告基因。

7.权利要求1所述的携带外源治疗基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体用于制备治疗肿瘤药物中的应用。