[发明专利]全密闭式靶核酸扩增产物快速荧光检测方法及装置

说明书

技术领域

本发明全封闭靶核酸扩增产物的检测装置，更具体地说，涉及利用荧光探针技术在全封闭检测装置中快速检测靶核酸扩增产物的方法，本发明还涉及了利用该全封闭的快速检测装置快速检测靶核酸扩增产物的试剂盒及其在检测传染病病原体中的用途。

现有技术

核酸研究已有100多年的历史，20世纪60年代末、70年代初，人们致力于研究基因的体外分离技术，1983年美国科学家Kary Mullis驱车在蜿蜒的州际高速公路上行驶，孕育出了PCR的雏形。经过两年的努力，在实验上证实了PCR的构想，并于1985年申请了有关PCR的第一个专利，在science杂志上发表了第一篇PCR学术论文。从此PCR技术得到了生命科学界的普遍认同。Kary Mullis也因此获得了诺贝尔化学奖。

PCR技术本身非常简单，且能最大限度地满足生物学家操作DNA的不同要求。PCR技术又以惊人的速度发展，并渗透到各生物学分支科学和临床各科的速度也令其它生物技术望而生叹。PCR在分子生物学、医学研究、生命科学、生物工程、遗传工程、疾病诊断、法医学、考古学等许多科学领域中都具有重要的实际应用价值，并对已建立的基因克隆、DNA序列分析等现代分子生物学技术的发展起到巨大的推动作用。PCR能提供基因物质的十分可信的精确分析，比任何现有技术敏感1万到100万倍。有人预测，21世纪为生物世纪，那么PCR便是生物世纪最重要的技术。

PCR具体应用有以下几个大的方面：

1、PCR可用于肿瘤的早期诊断和肿瘤治疗效果的测定

2、PCR可用于病源微生物的测定，如：HAV、HBV、HCV、HIV、致病菌、病毒等。

3、遗传性疾病的诊断。

4、早老性痴呆的诊断和治疗及巴金森氏病的诊断。

5、法医鉴定分析，如：亲子鉴定、犯罪现场标本分析。

PCR产物一般为10¹³拷贝/ml，取0.1ml即为10⁹拷贝，而1mg人基因组DNA才含1.4×10⁶拷贝的单拷贝基因片段，因此使得PCR扩增反应具有强大的扩增能力，提高了检测的敏感性。正是由于PCR反应具有强大的扩增效率，也导致其易污染的缺点，极微量的污染便可导致假阳性结果。PCR反应中，主要存在三个污染源：1.标本间的交叉污染；2.实验室克隆质粒的污染；3.PCR扩增产物的污染。其中以第三个污染源最主要，通过下面一个例子便可认识到PCR产物污染的严重性。在100ml的反应管中可产生10¹²拷贝个分子，若将这些分子在一个标准奥林匹克游泳池(50m×25m×2m)内稀释后，0.1ml稀释液含有400拷贝的扩增分子，远远超过了PCR扩增反应检测数个拷贝的极限。因此，PCR检测微量感染因子时，一定要注意产物残留污染的问题，对临床实验室尤应如此。所以如何消除PCR假阳性结果则成了科研工作者们要解决的一大难题。

为了能解决PCR扩增产物污染所造成的假阳性，许多学者也是想尽各种办法来解决这个问题。

PCR反应前后工作区的隔离：包括试剂的准备和配制；临床标本的处理，提取DNA模板；模板的扩增；扩增产物的检测和检定等。隔离PCR反应前后工作区，并且在PCR操作中封闭加罩，可提高扩增序列的特异性。目前认为将PCR反应工作分为：试剂配制区、模板制备区、PCR反应区、产物检测区四部分；工作区环境应坚持经常紫外线消毒，这是防止PCR污染的最主要措施。

使用PCR预防污染试剂盒：PCR污染预防试剂盒为采用修饰的dUTP(UNG)取代PCR反应系统中的dTTP。扩增后产物可在下次PCR反应之前经尿嘧啶糖基酶(UNG)作用下被特异性降解，而此酶对天然的核酸模板毫无影响，因此先前扩增产物污染PCR系统，也不能成为下次PCR扩增的模板，从而可以根本上清除PCR污染dUTP扩增产物。同天然DNA一样具有模板、杂交、克隆性质，只是对限制性内切酶作用有所影响。此外也可用dU代替引物中dT，从而使UNG一开始就可以阻断污染的引物扩增。使用PCR预防污染试剂盒应注意：PCR反应中退火温度最好高于5℃，因为UNG在5℃以下才具有活性，如果退火温度低于5℃，变性后残余的DNA可降解新合成的dUDNA。通常95℃并不能完全灭活UNG；扩增产物最好立即检测。