[发明专利]利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法

说明书

技术领域

本发明属于作物转基因成分的检测技术领域，具体涉及利用量子点检测转基因水稻中Bt蛋白的方法，本发明与ELISA方法相关。 

背景技术

转基因生物的安全评价是转基因生物及其产品市场化和商品化的前提，在安全评价中转基因成分的检测是一项重要内容，建立转基因生物快速、简便、准确的检测方法为安全评价和管理奠定基础。 

我国对转基因水稻的研究处于世界领先水平，其中，研发的一些抗病、抗虫转基因水稻品系已经申请生产种植用生物安全证书，但由于它们的转基因生物安全问题等一些原因，至今尚未有品系批准商业化生产应用。鉴于转基因水稻技术的成熟以及其产品市场化的趋势，因此建立一种快速、简便的检测Bt蛋白的方法，具有必要性和紧迫性。 

目前对于转基因成分的检测可从外源基因的核酸和蛋白质两个水平进行。核酸水平的检测，主要针对转入的外源基因的核苷酸序列并根据外源基因与内源基因的同源性设计检测方法，主要采用的方法是PCR扩增，即依据转入外源基因的启动子、目的基因、终止子及表达(重组)载体信息，设计特异性引物，进行聚合酶链式反应，依据产物的有无或多少判断是否为转基因产品。PCR反应具有高灵敏度、高特异性、高效性的特点，是转基因产品初筛阶段的主要检测方法。 

蛋白检水平的检测，主要是基于抗原和抗体相互作用的免疫学方法，针对转基因植物及其产品中外源目的基因表达的特异性蛋白进行定性和定量检测。1971年瑞典的Engvall等人分别以纤维素和聚丙乙烯试管作为固相载体吸附抗原/抗体，建立了酶联免疫吸附法(Enzyme Linked Immunosrbent Assay，简称ELISA方法)。1974年Voller等人改用聚苯乙烯微量反应板作为固相免疫吸附载体，使ELISA方法得以推广应用，使得用于抗原定位的酶标记抗体技术发展成为液体标本中微量物质的测定方法，并逐渐成为抗原抗体检测中最为常用的一种方法。它将酶标记物同抗原抗体复合物的免疫反应与酶的催化放大作用相结合，既保持了酶催化反应的敏感性，又保持了抗原抗体反应的特异性，因而极大的提高了灵敏度。同时它又是一种非均相免疫分析方法，即在反应的每一步都有洗涤过程，从而除去了未反应物和干扰物质。由于ELISA方法具有灵敏度高、特异性强、操作简便、检测迅速和非放射性以及可以批量测定等诸多优点，使得ELISA方法得到了越来越广泛的应用。 

但是随着检测灵敏度的要求越来越高，具有独特荧光特性的量子点越来越受到人们的关注。 

量子点(quantumdots)是一种由II族～VI族或III族～V族元素组成的、稳定的、溶于水的、介于1nm～100nm的、能够接受激发光产生荧光的半导体纳米晶粒。当它的物理尺寸小于激子的玻尔半径时，由于量子限制效应，使其具有独特的光学和电子学性质。它的光学性质主要取决于它的半径的大小，而与它的组成无关，通过改变量子点的大小就可以获得从紫外到近红外范围内任意点的光谱。 

由于具有独特的荧光特性，量子点与传统的有机荧光染料相比具有以下优点： 

(1)具有宽的激发波长范围和窄的发射波长范围，即可以使用小于其发射波长10nm的任意波长的激发光进行激发，这样就可以使用同一种激发光同时激发多种量子点，发射出不同波长的荧光，因而可用于多种标记物的同时检测。 

(2)量子点的发射峰窄而对称，且连续分布，重叠小，这样，在一个可检测到的光谱范围内可同时使用多个探针，而发射光谱不出现交叠，使生物分子的多组分分析检测变得容易。而传统的有机荧光染料的发射峰不仅宽，而且不对称，拖尾严重，互相重叠严重，容易互相干扰，给分析检测带来难以解决的难题。 

(3)量子点的发射波长可通过控制它的大小和组成来调谐，可以任意合成所需波长的量子点，大小均匀的量子点谱峰为对称高斯分布，而传统的有机荧光染料的峰形则为对数正态分布。 

(4)量子点的荧光强度比最常用的有机荧光染料罗丹明6G染料高20倍，它的稳定性更是罗丹明6G染料的100倍以上，而且量子点抗光漂白能力强。 

(5)生物相容性好，尤其是经过各种化学修饰之后，可以进行特异性连接，细胞毒性低，对生物体危害小，可进行生物活体标记和检测，而传统的有机荧光染料一般毒性较大，生物相容性差。 

(6)荧光寿命长，典型的有机荧光染料的荧光寿命仅为几纳秒(ns)，这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当。而量子点的荧光寿命可持续长达数十纳秒(20ns～50ns)，这使得当光激发数纳秒以后，大多数的自发荧光背景已经衰减，而量子点荧光仍然存在，此时即可获得无背景干扰的荧光信号。