[发明专利]高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，特别涉及一种高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，并对该菌株发酵生产S-腺苷蛋氨酸的过程进行了优化，S-腺苷蛋氨酸的产量可达4.37 g/L，达到工业化生产水平。

背景技术

S-腺苷蛋氨酸英文名为S-adenosylmethionine，简称SAM，化学名称为5'- [[(3S)-3-氨基-丙基]甲基-(S)-砜]-5'-脱氧腺苷，分子式C₁₅H₂₂N₆O₅S，分子量为399。

S-腺苷蛋氨酸是广泛存在于生物体内的一种重要生理活性物质，具有转甲基、转硫基、转氨丙基等作用，参与了体内40多种生化反应，与蛋白质、核酸、神经递质、磷脂质和维生素的合成密切相关，并连接多胺和谷胱甘肽的转化。近年来的研究表明，S-腺苷蛋氨酸对肝病、抑郁症、关节炎、纤维性肌痛、偏头痛等疾病具有治疗作用。（1）治疗肝病。大量临床研究证明，SAM对各种原因引起的肝功能异常有良好疗效，包括各种原因引起的慢性肝炎、原发胆汁性肝硬化、药物性胆汁淤积、妊娠性胆汁淤积等。（2）治疗抑郁症。与其他抗抑郁药不同，SAM抗抑郁作用无计量相关性，起效快，几乎无不良反应，耐受性好。（3）治疗关节炎。与非类固醇类抗炎药性比，SAM既不抑制前列腺素合成，也不会损伤胃肠道。（4）治疗纤维性肌痛、偏头痛。SAM可以使止痛药用量降低，改善患者情绪。此外，SAM还可以治疗阿尔茨海默氏症、癫痫、帕金森氏病、亚急性脊髓变性以及HIV引起的神经性并发症等。

目前，SAM主要从大肠杆菌、酵母、链霉菌中分离纯化制得。但是由于SAM的表达量小，纯化蛋白步骤烦琐，SAM稳定性差、易发生失活反应，产物得率低。尤其在国内，尽管很早就开始研究，虽然近几年取得一定进步，但因技术水平较低、成本过高仍未能够产业化，相关产品长期依赖进口，价格昂贵，远远不能被普遍使用，严重阻碍了市场拓展，研究和开发新的制备方法已成为当务之急。

采用基因工程和发酵工程相结合的方法将有望降低成本且能大规模生产S-腺苷蛋氨酸。随着基因工程技术的完善和发展，不断地有新的基因工程产品面市，目前至少有50%以上的重组蛋白药物是用基因工程技术生产的，如人胰岛素、干扰素、白细胞介素-2、生长激素、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、表皮生长因子等。表达系统是基因工程及生物制药研究和应用的重要内容，也是生命科学研究领域的热点。毕赤酵母是单细胞低等真核生物，它既具有原核生物易于培养、繁殖快、便于基因工程操作和高密度发酵等特性，同时又具有适于真核生物基因产物正确折叠的细胞内环境和糖链加工系统，有多种受体菌和表达载体可供选择，可进行胞内表达或分泌表达，是良好的表达系统。 

SAM有着巨大的国际市场需求，据国际卫生组织有关的报告：目前，全球每年用在治疗肝病和帕金森氏病等疾病的SAM大约需要450-500t左右。SAM在国内的市场也非常广阔。我国是肝炎流行的大国，而我国目前尚无一种真正改善肝细胞代谢的生物药物。同时，随着社会物质生活水平的不断提高和社会竞争的持续加剧，患有脂肪肝等肝病患者的人数越来越多，抑郁症人数也与日俱增，S-腺苷蛋氨酸的需求量将会日益增加。

发明内容

本发明的目的在于提供一种高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法。

高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）从酿酒酵母基因组中PCR扩增出S-腺苷蛋氨酸合成酶基因sam2，连接至质粒pPIC9K中，得到真核表达载体pPIC9K-sam2，然后将其转化到巴斯德毕赤酵母；

（2）从毕赤酵母基因组中PCR扩增出胱硫醚β合成酶基因cbs，将其亚克隆至载体pMD19T中，得到重组载体T-cbs；将博莱霉素抗性基因zeocin导入重组载体T-cbs的胱硫醚β合成酶基因，得到cbs基因敲除质粒T-C-Z，酶切后获得cbs基因敲除片段C-Z；

（3）将片段C-Z转化至步骤1 所得的包含pPIC9K-sam2的巴斯德毕赤酵母，得到敲除cbs基因又强化sam2基因的高产S-腺苷蛋氨酸的巴斯德毕赤酵母菌株。

进一步地，步骤1中S-腺苷蛋氨酸合成酶基因的扩增引物序列为：

Sam2-F：5’-CAGGATCCACCATGACCAAGAGCAAAACT-3’

Sam2-R：5’-GCGGCCGCGAATTCAGCCTAGCATAAAGAAA-3’。