[发明专利]Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途

说明书

技术领域：

本发明属于分子生物学领域，涉及Grp75基因新的用途，具体涉及应用基因转染技术Grp75在制备治疗肝细胞氧化损伤和肝脏纤维化药物中的用途。

背景技术：

肝纤维化是肝脏对各种原因所致肝损伤的创伤愈合反应，表现为肝内结缔组织增生与沉积。现代研究表明，常见多发的急，慢性肝病例如病毒型肝炎，脂肪肝，酒精肝等大部分病例在早期均表现为肝纤维化，如果不能及时发现并有效抑制，将可能进一步发展成为肝硬化乃至肝癌，直接危及患者生命。据研究显示，正常肝细胞损伤被视为激活肝纤维化的最初信号，随着肝细胞的持续受损，凋亡，肝纤维化将不断加剧。因此，阻止或者延缓肝纤维化的发生，预期可治愈多数慢性肝病。

研究报道，肝细胞的氧化损伤的发生是肝纤维化的早期的病理过程，肝纤维化是肝脏内纤维结缔组织增生导致的慢性疾病，在肝纤维化的病理过程中，肝星形细胞的激活，是其显著的特征，而肝细胞的氧化损伤和凋亡往往是肝纤维化发生的始动因素。葡萄糖调节蛋白75(简称Grp75)是细胞质和线粒体内的一种重要的分子伴侣，在缺糖、辐射等应激条件下，Grp75呈上调表达，以起到保护蛋白质，协助蛋白质(特别是线粒体蛋白质)转运，提高细胞对应激反应耐受性的作用。Grp75在缺糖损伤时通过减少ROS和脂质过氧化物的产生，以及增加ATP水平保护细胞。(YanLIU，WenLIU，XiaodongSONG，JiZUO.Effect of Grp75 over expression on intracellular ATP level，mitochondrialmembrane potential and ROS accumulation following glucose deprivation in PC12cells[J].Molecular and Cellular Biochemistry 2005，(268)：45-51；Zuo J，Xia Bl，Massa SM，et al.GRP75 is upregulated in ischemic brain.[J].J.Neurochem.1996，67：S33A.)同时GRP75能通过阻止Bax构象改变、延迟Cyt C释放抑，调控Raf/Mek/Erk途径等细胞凋亡通路，从而对缺糖等应激造成的细胞凋亡起到抑制作用。p53蛋白的C端312～352氨基酸残基处具有Grp75结合信号，Grp75与p53发生结合，可抑制p53移位到线粒体和核，继而分别抑制了p53介导的线粒体凋亡途径和转录依赖性凋亡途径。所以Grp75可以通过多种作用机制抑制细胞凋亡，对细胞损伤起到保护作用。(Wadhwa R，Takano S，Kaur K，Deocaris CC，Pereira-Smith OM，Reddel RR，Kaul SC.Upregulation of mortalin/mthsp70/Grp75 contributes to human careinogenesis.Int J Cancer.2006 Jun 15；118(12)：2973-80.)

Grp75在心脏、脑、肺、脾等多种组织中有构成性表达，当细胞损伤发生时，伴侣分子Grp75可以应激性上调，起到细胞保护效应，抑制细胞凋亡进程。然而Grp75在肝组织中却没有构成性表达(李华，杨增杰，夏蓓莉，左伋.葡萄糖调节蛋白75的表达特性.[J].复旦学报(医学科学版)，2001，28(5)：382)，如何在肝细胞发生损伤时，我们将GRP75的基因转入，分别在细胞和整体水平上上使Grp75上调表达，进一步产生其抗氧化损伤作用和抑制肝细胞凋亡的作用已引起有关领域研究者的关注。

发明内容：

本发明的目的是提供Grp75基因新的用途，具体涉及Grp75基因在制备治疗肝脏纤维化药物中的用途。尤其涉及Grp75对肝细胞的过氧化氢造成的损伤保护作用和Grp75对由CCL₄诱导的肝纤维化的治疗作用。

具体的，本发明采用7702细胞进行细胞实验，通过加入H₂O₂(400umol/ml)的DMED培养基建立肝细胞氧化损伤模型，用MTT法检测正常组和Grp75上调组在给予氧化损伤的细胞存活率影响；用赖式法检测AST，ALT等血清学指标，用荧光探针标记ROS和线粒体跨膜电位用荧光显微镜观察其变化；