[发明专利]同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，涉及一种液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的检测方法。

背景技术

醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesterone acetate，MPA)是一种孕激素类药物，在兽药中被作为促生长剂，广泛用于安情助长和同步发情等方面以促进动物生长、提高饲料转化率、节省成本、提高经济效益，其对人具有广泛的毒副作用，能引起精神抑郁、过敏等不良反应，甚至引起乳腺癌和不孕不育症。欧盟成员国早已明令严禁在食源性动物饲养管理中使用，我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定醋酸甲羟孕酮为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。己烯雌酚(diethylstilbestrol，DES)是一种非甾体激素，曾被广泛用于促进动物生长、增加瘦肉率，其药物原形或代谢产物不可避免地残留于食品动物的器官、组织或通过排泄物进入外界环境，成为环境雌激素，具有导致畸胎、癌瘤等严重的毒负作用。美国食品药物管理局(The US Food and Drug Administration，FDA)早在1979年就已禁止己烯雌酚用于动物催肥。1989年，欧盟对一切含有促生长激素的动物和动物性食品实施封关禁入。

我国农业部2002年《动物性食品中兽药最高残留限量》文件中明文规定该药为禁止用于所有食品的动物兽药，食品中不能检出。但是部分畜禽养殖户盲目追求经济效益、滥用DES的现象仍然存在。

发明内容

本发明要解决的问题是提供一种可同时检测水产品中MPA和DES的方法。旨在解决兽药残留检测单一、耗时、成本高等问题，也为进一步同时检测四个兽药残留指标奠定了基础。该方法的建立可满足水产品中甲孕酮和己烯雌酚检测快速、准确的要求，同时，为我国水产品兽药残留的日常监控提供一种新的适用方法。

本发明提供了一种同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的方法，所述方法具体步骤包括以下步骤：

(1)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的人工抗原；

(2)分别制备醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的单克隆抗体并纯化；

(3)利用步骤(1)得到的人工抗原分别偶联液相芯片荧光微球；

(4)利用步骤(2)得到的单克隆抗体进行生物素化；

(5)使用步骤(3)得到的偶联的微球以及步骤(4)得到的生物素化的抗体，通过液相芯片法同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留。

所述的步骤(2)中，醋酸甲羟孕酮的单克隆抗体的腹水效价为1∶2.56×10⁶。

所述的步骤(2)中，己烯雌酚的单克隆抗体1F5的腹水效价为1∶3.2×10⁶。

所述的步骤(2)中，己烯雌酚的杂交瘤2D8细胞腹水效价分别为1∶1.6×10⁶。

步骤(5)中，所述的检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚残留的步骤依次为：偶联有MPA和DES的微球加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，随后分别加入生物素化的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚抗体；然后加入稀释好的SA-PE，最后加入终止液，检测荧光强度。

步骤(5)中，包被好的微球一部分加入处理好的醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚样品溶液，另一部分加入系列醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚标准溶液；标准溶液的浓度包括25ng/mL、12.5ng/mL、6.25ng/mL、，3.125ng/mL、1.6ng/mL、0.8ng/mL和0.4ng/mL。

所述的检测荧光强度是通过Luminex 200仪器检测荧光强度值，并用Luminex version2.1软件分析数据。

检测醋酸甲羟孕酮的抗体稀释度为1∶3000。

检测己烯雌酚的抗体稀释度为1∶6400。

所述的SA-PE的稀释度为1∶100。

具体而言，本发明的方法包括如下步骤：

1，制备醋酸甲羟孕酮人工抗原；

2，醋酸甲羟孕酮单克隆抗体的制备和纯化；

3，制备己烯雌酚人工抗原；

4，己烯雌酚单克隆抗体的制备和纯化；

5，醋酸甲羟孕酮特异性单克隆抗体和己烯雌酚单克隆抗体的生物素化；

6，分别制备耦联有醋酸甲羟孕酮抗原和己烯雌酚抗原的液相芯片荧光微球；

7，建立同时检测水产品中醋酸甲羟孕酮和己烯雌酚的液相芯片法。

步骤1中，所述醋酸甲羟孕酮抗原的制备方法具体为：将醋酸甲羟孕酮与卵清白蛋白进行偶联，形成人工抗原。