[发明专利]一种无血清低温保护剂

说明书

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，具体涉及一种无血清低温保护剂。

背景技术

目前体外制备的动物细胞低温储存保护剂主要采用含血清的DMSO溶液，但经过这种低温保护剂储存的细胞制剂血清残留很难清除，而且血清成分复杂，限制了细胞制剂的用途。

间充质干细胞与其它成体二倍体细胞不同，是一种具有自我更新和多向分化能力的细胞，具有广泛的医疗用途，其低温储存对配方有更高的要求，为了满足临床需要，低温保护剂最好不含有血清成分。

无血清低温保护剂是间充质干细胞低温保护剂的发展方向，现有技术已经公开采用了PEG或海藻糖作为低温保护剂，也披露了IV型胶原蛋白在人胚胎干细胞低温储存中的作用。

发明内容

本发明的目的之一是提供一种无血清低温保护剂，在于解决现有技术中含血清的低温保护剂血清成份复杂、血清残留难清除的问题及无血清低温储存试剂成分不明确的问题。

为达到上述目的，本发明采取了如下技术方案：

一种无血清低温保护剂，包括细胞内渗透保护剂和细胞外保护剂，其特征在于：所述细胞外保护剂由NaCl、KCl、Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂PO₄、PEG(400～2000)、D-海藻糖和胶原IV(IV型胶原蛋白)组成，所述细胞内渗透保护剂为DMSO(二甲基亚砜)，所述PEG(400～2000)是聚乙二醇的分子量在400～2000之间。

进一步的技术方案是，每100mL无血清低温保护剂中，所述细胞外保护剂组成成份的重量为：NaCl为800mg、KCL为20mg、Na₂HPO₄.12H₂O为290mg、KH₂PO₄为24mg、PEG(400～2000)为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g、胶原IV为100ug～1000ug，所述细胞内渗透保护剂DMSO为5mL～15mL。

一种制备无血清低温保护剂的方法，

步骤一：将NaCl、KCl、Na₂HPO₄.12H₂O、KH₂PO₄、PEG(400～2000)和D-海藻糖全溶于注射用水中，溶液40℃保温；

步骤二：步骤一所述溶液降温至20℃后，加入胶原IV，溶液20℃保温；

步骤三：在无菌环境中将步骤二所述加入胶原IV后的20℃保温溶液过滤除菌；

步骤四：将无菌DMSO溶入到步骤三经过滤除菌的溶液中，得到无血清低温保护剂。

进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤一的NaCl为800mg、KCl为20mg、Na₂HPO₄.12H₂O为290mg、KH₂PO₄为24mg、PEG(400～2000)为5～15g、D-海藻糖为3.423g～6.846g，所述的注射用水为60mL。

进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤二胶原IV为100ug～1000ug，加入胶原IV100ug～1000ug后的溶液定容至85mL～95mL。

进一步的技术方案是，所述步骤三的过滤除菌，使用孔径为0.22um的无菌亲水滤膜。

进一步的技术方案是，每100mL的无血清低温保护剂中，所述步骤四的无菌DMSO为5mL～15mL。

更进一步的技术方案是，所述的一种无血清低温保护剂，用于冻存间充质干细胞，所述间充质干细胞包括人和动物的骨髓、肌肉、皮肤、肝脏、肾脏、心脏、骨骼、脑、肺脏、消化道、胎盘、羊膜、羊水、脐带、脐带血、外周血。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本发明不含有任何来源的血清成分，在低温储存细胞时不会有血清成分残留。

(2)本发明成分明确、简单，易于配制。

(3)本发明可用于间充质干细胞的低温储存。

附图说明

图1为实施例2的不同低温保护剂低温冻存人骨髓间充质干细胞后F-CFU和存活率的检测结果示意图。

具体实施方式

实施例一