[发明专利]重组融合毒素VEGF165-melittin及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程药物领域，具体涉及一种重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin及其制备方法和应用。

背景技术

恶性肿瘤的预防与治疗一直是世界难题，血管生成对肿瘤的生长和转移有着至关重要的作用。肿瘤发生时能促进血管生成因子分泌，其中最主要的是血管内皮细胞生长因子( Vascular endothelial growth factor，VEGF )。大量研究结果表明VEGF通过其加速新血管生长的作用而促进肿瘤细胞的增殖和扩散，与多种实体瘤如肝癌、乳腺癌、肺癌、结肠癌、卵巢癌、胃癌、胰腺癌的发生、发展与转移密切相关。而以血管定向的靶向药物，尤其以VEGF受体为靶向的融合毒素兼具与VEGF受体结合，阻断VEGF/VEGFR信号通路与杀伤血管内皮细胞的双重作用，除了抑制肿瘤新生血管形成外，还能够破坏已生成的肿瘤血管，是更有前景的治疗手段，同时在视网膜疾病、艾滋病等方面亦有潜在的应用价值。VEGF的mRNA经过剪切可形成四种不同的异构体，VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅、VEGF₁₈₉和VEGF₂₀₆，它们的主要区别是与肝素及细胞外基质的结合力不同。已有研究报道在这四种VEGF的异构体中，以VEGF₁₂₁和VEGF₁₆₅为靶向载体，可以产生更强的细胞毒性效果，这可能与VEGF₁₂₁、VEGF₁₆₅有更多的特异性受体有关。

国外已有学者将VEGF₁₆₅与白喉毒素结合形成大分子融合蛋白靶向抑制肿瘤血管的生成，Hotz等也将VEGF₁₂₁与志贺祥菌毒素融合并进行了抗肿瘤活性检测，但是这些常用的毒素分子量大，而且必须首先要通过细胞内化作用才能进入细胞发挥作用，这些都影响了其抗肿瘤作用的发挥。

蜂毒肽 (melittin) 是由26个氨基酸组成的小分子毒素，具有分子量小、易于深入实体瘤内部的优点，其发挥作用的主要机理是使细胞膜的通透性增加，细胞内容物泄露，细胞裂解，无需经过细胞内化而直接发挥作用，这使得melittin非常适合作为“弹头”用来制造融合毒素进行抗肿瘤的靶向治疗。但目前还没有相关方面的报道。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术仅仅以阻断VEGF/VEGFR信号通路抑制肿瘤新生血管为目的的靶向治疗方法存在的问题，提供一种兼具血管靶向与破坏已生肿瘤血管，并能杀死肿瘤细胞的双重作用的新型重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin，为抗肿瘤靶向治疗技术的研究和发展提供基础。

本发明通过以下技术方案实现上述目的：

一种重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin，是通过连接肽在蜂毒素短肽melittin的氨基端连接VEGF₁₆₅得到，或通过连接肽在VEGF₁₆₅的氨基端连接蜂毒素短肽melittin得到；所述连接肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。也就是说，融合毒素分子中，VEGF₁₆₅与蜂毒素的连接次序或位置是可以互换的。

其中所述VEGF₁₆₅和蜂毒素短肽melittin分别与天然人VEGF₁₆₅和天然蜂毒素至少有90%的序列同源性。

所述重组融合毒素的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。或为将SEQ ID NO:2的氨基酸残基序列经过一至十个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的蛋白质。

本发明还保护上述重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的编码基因。该编码基因的核苷酸序列为编码SEQ ID NO:2所示蛋白序列的基因，具体核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，或者与SEQ ID NO:3所示序列具有90％以上同源性且具有选择性杀伤肿瘤新生血管内皮细胞作用的核苷酸序列。或者在高严谨条件下可以与SEQ ID NO:3所示序列杂交的核苷酸序列。

一种重组融合毒素VEGF₁₆₅-melittin的表达载体，由VEGF₁₆₅-melittin的编码基因插入到出发载体的多克隆位点构成，所述出发载体优选为pPICZa，pPIC9或pHIL-sl。

含有上述表达载体的转基因细胞系或宿主菌。