[发明专利]一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌及应用

权利要求书

1.一种表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌，其特征在于：所述工程菌是一种能够外源表达定向进化的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌，由如下方法构建获得：

(1)设计并合成PCR引物，自施氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri SDM)CCTCC No.M206010菌株的基因组中扩增L-iLDH的基因lldD(Genbank序列号GU373722)；其中所述引物是：

上游引物lldU：AAGCTTATGATCATTTCCGCCTCTACC，

下游引物lldD：CTCGAGTCAGACGTCAGCAGACGTTG；

(2)选取L-iLDH基因lldD中的108位的缬氨酸作为目标位点，设计并合成含有突变位点的PCR引物，通过PCR反应，将lldD基因第323的胸腺嘧啶核苷酸(T)改变为胞嘧啶核苷酸(C)，即相应于将蛋白质序列108位的缬氨酸(Val)突变为丙氨酸(Ala)，得到突变L-iLDH基因mlldD；其中所述引物是：

上游引物lmU：TTCACCCTTTCCACCGCGTCGGTCT，

下游引物lmD：GGGAATCCCTTTCTTGTCTGCCGC；

(3)以含有T7启动子和氨苄青霉素抗性的大肠杆菌宿主适用表达载体pETDuet-1出发，将突变L-iLDH基因mlldD序列通过T4DNA连接酶连接至表达载体，构建表达载体pETDuet-1-mlldD；

(4)使用化学转化的方法将表达载体pETDuet-1-mlldD转化至大肠杆菌C43(DE3)所制备的感受态细胞中，将转化细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的固体LB培养基上，筛选得到含有连接突变L-iLDH基因表达载体的转化子，即得到表达突变蛋白的烟酰胺腺嘌呤双核苷酸(NAD)非依赖型L-乳酸脱氢酶的工程大肠杆菌。

2.权利要求1所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌在拆分外消旋扁桃酸中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于：所述表达定向进化L-乳酸脱氢酶的工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分，同时生产手性纯R-扁桃酸以及苯乙酮酸。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：所述工程菌的全细胞作为催化剂进行外消旋扁桃酸的拆分的方法是：

(1)制备表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞催化剂：将工程菌种子以体积比1％的接种量接种至LB培养基中，37℃培养；OD₆₂₀nm达到0.5～0.7时，加入终浓度为0.8～1.2毫摩尔/升的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，开始诱导突变蛋白进行表达；继续在30～37℃诱导蛋白表达6～10小时后，终止培养；分离并收集菌体，用pH 7.4磷酸钾缓冲液洗涤菌体2次，菌体重悬于去离子水中，得到作为催化剂的表达定向进化L-乳酸脱氢酶工程菌的完整细胞悬液；

(2)将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入20～25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为20～40克/升；催化剂完整细胞浓度 为80～120克湿细胞/升，在30～42℃，pH 6.5～7.5条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以120转～180转/分钟振荡培养36～48小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于：步骤(2)所述方法是将上述催化剂与外消旋扁桃酸钠水溶液混合，加入25毫摩尔/升的乙二胺四乙酸(EDTA)，使混合物中外消旋扁桃酸钠的浓度为40克/升；催化剂完整细胞浓度为100克湿细胞/升，在37～42℃，pH 7.0条件下，使底物外消旋扁桃酸钠、催化剂与氧气充分混合，并以150转/分钟振荡培养40～45小时，得含R-扁桃酸钠以及苯乙酮酸钠的转化液。