[发明专利]一种乙型肝炎病毒基因分型PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种疾病病原体基因检测技术，尤其涉及一种乙型肝炎病毒基因分型检测试剂盒(PCR-荧光探针法)。

背景技术

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)是严重危害人类健康的肝炎病毒之一，是重要的肝脏疾病致病因子。世界上有20亿人感染过HBV，目前全世界慢性HBV感染患者至少有3.8亿，其中慢性HBV携带者75％分布在东南亚和次撒哈拉地区，而我国就占了1.5亿，其中有2000万人为慢性乙肝患者，每年因此病死亡的人有近50万。估计全球每年有100-200万人直接死于HBV持续感染。

HBV属于嗜肝DNA病毒科，是一种DNA病毒，其基因组由长3.2kb的部分双链DNA组成，共有四个开放读码框(Open Readin Frame，ORF)：S、C、P、X，他们编码至少8个不同蛋白：表面抗原蛋白，DNA多聚酶蛋白，核心抗原蛋白，X蛋白等。HBV具有病毒复制产量高(10^12-13病毒粒/天)和突变率高(10^10-11个点突变/天)的特征，高突变是由于高复制，尤其是由于基因组复制，需先转录为RNA中间体，但聚合酶缺乏校正功能所致。根据HBV全基因核苷酸序列异源性大于8％或S基因区核苷酸序列异源性大于4.1％，可将HBV分为A、B、C、D、E、F、G、H8个基因型。

HBV基因型呈一定的地域性分布：在世界不同地区基因型分布不同，A型为全世界分布，B型、C型主要分布在亚洲，D型分布在南欧、美、澳大利亚和中东，E型分布在非洲，F型分布在美洲土著人和波利尼西亚，G型分布在美洲、欧洲，H型在美国发现。目前我国HBV分布主要以B型和C型为主，兼有少量的A型和D型，在香港、广州等南部地区有少部分D型分布，另外，华北、新疆地区有A型存在。

研究证实，乙肝病毒基因型与乙肝发病机制、转归、抗病毒疗效均有密切关系。不同的基因型其临床感染特点和致病性也不完全相同。因此，对患者血清中HBV-DNA基因型的测定，对于指导临床医生根据不同的基因型及临床表现制定不同的治疗方案和预后判断有着积极的作用。

国内外对HBV进行基因分型的方法可分为全基因序列比对和片段基因序列比对两大类。全基因序列比对是以生物系统发生学中的基因同源性为基础的，它主要是通过HBV全基因序列测定来进行基因分型，另外，也可应用对HBV全基因进行限制性片段长度多态性分析技术(RFLP)。片段基因序列比对是利用HBV中的代表性片段的序列类型来反映全基因序列的类型，主要技术类型有片段基因序列测定、PCR-RFLP、型特异引物(SSP)扩增法和型特异探针(SSO)检测法等。序列测定虽然结果准确可靠，但是由于其技术复杂、实验流程长、实验条件要求高、耗时长和费用昂贵难以作临床常规使用，目前只作为实验室研究使用；RFLP技术相对简单，但是酶切位点易受基因变异影响，且遇混合感染或酶切不完全，会出现复杂条带，影响分型结果判断；应用SSP法进行PCR扩增需要多个扩增管，使用常规的PCR后产物电泳的方法也容易污染，其灵敏性比特异性探针低；应用SSO法可通过对单管的PCR产物进行检测来分型，因此具有操作相对简单和费用较低等特点，具有实用价值。

实时荧光PCR反应是利用热稳定DNA聚合酶5’→3’外切酶活性，在一对特异性引物之外，加入一条和模版互补的基因特异性探针(Taqman探针)，探针上5’端和3’端分别标记了一个报告荧光基团(供体)和一个淬灭荧光基团(受体)，在反应初始(探针完整)时系统激发供体而产生的荧光信号被临近的淬灭基团吸收，所以此时检测不到供体荧光信号；而当PCR反应过程中，随着链的延伸，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光标记探针的结合位置，由于它的5’→3’外切核酸酶活性，将荧光探针切断，释放出报告荧光基团的荧光信号，每合成一条新生链，就有一个报告基团的信号释放，被释放的激离报告荧光基团的数目和PCR产物是一对一的关系。通过荧光PCR仪定时动态监测每一循环，可以得到样品实际扩增曲线，找到PCR扩增的对数期，可以对样本作定性定量检测。

荧光PCR的优点是反应灵敏、特异性高：具有模版序列特异的Taqman探针在引物特异的基础上进一步提高的PCR的专一性；每扩增一个特异产物只释放一个分子的荧光染料，仪器检测的是特异扩增的结果，非特异产物对检测信号没有影响，有效提高检测的专一性。有多种不同波长的荧光基团对可供选择，使得Taqman探针法可以实现在同一管内检测多重PCR，降低成本也提高效率和准确性避免了荧光染料对PCR反应的影响。

发明内容