[发明专利]一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程和现代酶工程技术领域，具体涉及一种来灰色链霉菌的海藻糖合成酶基因，该基因表达的海藻糖合成酶可以用于生产海藻糖。

背景技术

海藻糖是由两分子葡萄糖以α，α-1，1糖苷键相连而成的非还原性二糖，广泛地存在于微生物、虾类、酿酒酵母、蘑菇及各种真菌、昆虫、植物等。外源性的海藻糖同样对生物体及生物大分子、生物膜具有良好的非特异性保护作用，它可以保护细胞免受由于环境变化(如脱水、高渗)变化后造成的损害，具体表现为对生物膜、蛋白质和DNA等的有效保护，因此被誉为“生命之糖”。天然中海藻糖的含量很低，过去主要是从干酵母中提取，由于含量低，提取过程较复杂，成本极高。如此昂贵的海藻糖只能局限于某些特殊领域如医学生物制品的活性保持的应用，随着人类社会的发展和进步，希望能将海藻糖应用于日常生活所常用各类食品的鲜味保持与质地改善，更好提高人们的生活和健康水平，因此必须要尽快地找到廉价而高效的海藻糖制造方法。

目前已经在多种微生物中分离到多种不同类型的海藻糖合成酶及其相关的基因，目前发现的海藻糖合成相关酶和基因表明，微生物中合成海藻糖的途径可以分为三种途径，第一种途径是海藻糖磷酸化酶合成途径，主要由径6-磷酸海藻糖合成酶(Trehalose-6-phosphate synthase)和6-磷酸海藻糖酯酶(Trehalose-6-phosphate phosphatase)组成，首先由6磷酸海藻糖合成酶催化UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖合成6-磷酸海藻糖，然后再由6磷酸海藻糖酯酶脱磷酸后得到海藻糖；第二种途径是麦芽寡糖基海藻糖合成酶合成途径，主要是由麦芽寡糖基海藻糖合成酶(Maltooligosyltrehlosen，MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(Maltooligosyltrehalose trehalohydrolase，MTHase)组成，先由麦芽寡糖基海藻糖合成酶以麦芽糊精(Maltodextrin)为底物，通过分子内转糖基作用把麦芽糊精末端的两个葡萄糖分子间的α，α-1，4糖苷键转变成α，α-1，1糖苷键，形成麦芽寡糖基海藻糖(Maltooligosyltrehalose)。然后麦芽寡糖基海藻糖在麦芽寡糖基海藻糖水解酶的催化下从麦芽寡糖基海藻糖分子上水解下一个海藻糖分子，而原来的麦芽糊精则转变为减少了两个葡萄糖基的新寡糖，并可作为新的底物进行下一轮反应，如此反复就可以将麦芽糊精转化成海藻糖；第三种途径是海藻糖合成酶途径，与其它海藻糖合成途径不同是这种途径只有一种酶即海藻糖合成酶(Trehalose synthase，Tre S)组成，它作用的底物是麦芽糖(Maltose)，通过催化麦芽糖分子内转糖基，将α，α-1，4糖苷键连接的麦芽糖转化为α，α-1，1糖苷键，麦芽糖转变成海藻糖。第一种途径需要用到价格昂贵的高能磷酸化合物UDP-葡萄糖和6-磷酸葡萄糖为底物来生产海藻糖，在生产成本很难产生竞争优势，第二种和第三种途径是以淀粉的水解产物麦芽糊精或者麦芽糖为底物生产海藻糖，具有很强的竞争优势，第三种途径和第二种途径相比，第三种途径只需要一种酶，因此在利用基因工程菌生产酶时不需构建两种工程菌，在生产过程设备的占用率会更低，而且不需要考虑两种酶的反应条件是否一致，这样可以使生产工艺上会更简单，因而具有更强的竞争优势。

目前已有不少文献和专利报道了海藻糖合成相关基因的克隆和分离，以及这些海藻糖合成酶基因的相关酶用于制备海藻糖，但这些海藻糖合成相关酶的合成途径不同，或者菌种来源不同，导致了DNA序列和氨基酸序列相差甚远，酶的分子量、酶学特性以及酶对底物的转化率，而且目前都还没有得到工业规模化的应用。

发明内容

本发明目的是提供一种灰色链霉菌海藻糖合成酶基因及其应用，在转化麦芽糖生成海藻糖时能产生较高的海藻糖及产生较少的葡萄糖，并能避免生产过程中水和原料中金属离子对酶活力的抑制，有利于提高生产工艺的稳定性。

本发明人利用生物信息手段对GenBank中庞大的DNA序列和氨基酸序列资源进行同源性检索分析，对已经完成序列分析的上千种微生物的DNA序列进行大量核酸序列进行分析和对比，发现了在蛋白质的序列数据库Genbank中注释为“未知蛋白”或“推测是某功能蛋白质”的极为有用基因，推测该序列的功能，然后找到候选基因序列然后进行实验的功能鉴定，最终确定基因的功能和性质，其中包括至今为止人们并未发现的海藻糖合成酶基因(treS)，并用这种合成酶基因经过克隆和进行重组表达，再利用重组表达的海藻糖合成酶用于转化麦芽糖生产海藻糖。