[发明专利]5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶基因的分离

说明书

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及一种来源于深海海洋微生物基因组的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因的分离鉴定，其编码基因为AroA，通过遗传转化的方法，将该基因转入宿主细胞中，使宿主细胞获得耐受草甘膦的能力。本发明涉及该基因的核苷酸序列和氨基酸序列。 

技术背景

N-膦酰甲基甘氨酸，即草甘膦(glyphosate)，是大家熟知的一种内吸传导型的广谱灭生性除草剂，具有对人和牲畜低毒，在土壤中残留量低，使杂草难以产生抗性等特点，基于这些特点，草甘膦在全世界范围内得到广泛的应用。 

草甘膦能够抑制植物或微生物体中芳香族氨基酸合成过程中的一种重要的酶的活性，即5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)，这种酶催化莽草酸途径(shikimate pathway)的倒数第二步，将磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的酰基部分转移到莽草酸三磷酸(shikimate-3-phophate)的第5位羟基形成5-烯醇式莽草酸-3-磷酸(EPSP)和无机磷。由于草甘膦与PEP具有相类似的结构，可形成EPSP合成酶·S-3-P·草甘膦复合物，阻遏PEP与酶的结合，阻断芳香族氨基酸的合成途径，影响了植物的正常代谢，从而杀死绝大多数的植物，杂草和农作物都不例外。因此，为了能够在农作物生长的过程中选择性地除去杂草，农作物就必需获得抗草甘膦的能力(Dill 2005；Sun，Li et al.2006)。 

目前研究的草甘膦抗性基因AroA主要分为两类(He，Yang et al.2001)。I类AroA基因主要来源于植物或微生物，天然对草甘膦敏感，经改造后能够对一定浓度的草甘膦产生耐受性，但对底物PEP的亲和力会受到影响；II类AroA基因主要来源于根癌农杆菌CP4(Agrobacterium tumefaciens CP4)，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)和假单胞菌属PG.2982(Pesudomonas sp.)等，对底物PEP有高亲和力，且天然对草甘膦不敏感，这类基因已在生产实践中得到应用(参见美国专利453590，4769061，5094945)。这两类基因序列的氨基酸相同性低于30％。 

目前，在生产实践中应用的草甘膦抗性基因主要是上述的II类AroA基因，对I类AroA基因的研究相对较少，且目前发现的I类AroA基因大多天然对草甘膦敏感，此类研究主要选材于陆地微生物，而对草甘膦抗性较高的AroA基因大多被发掘并申请专利保护，给我国的实际应用造成很大的局限性。为解决这一局限性，本发明选取新的菌种资源，即海洋微生物，此类微生物基因组与陆地微生物基因组存在很大的差异，得到AroA基因与其他同类基因存在很大差异。 

发明内容

本发明的目的是提供一种来自深海海洋微生物基因组的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)基因 的分离鉴定，通过遗传转化方法，将该基因转入宿主细胞中，使宿主细胞获得耐受草甘膦的能力。