[发明专利]人胃癌肿瘤干细胞株GAM-016S的培养建立

说明书

技术领域

本发明涉及一种人胃癌肿瘤干细胞株的培养建立，属于细胞生物学细胞培养技术领域。 

背景技术

肿瘤组织中存在数量稀少的癌细胞，在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色，具有自我更新、增殖和分化的潜能，其众多性质与干细胞相似，因此被称为肿瘤干细胞(TIC)。由于在肿瘤的发生、发展、复发和转移中的重要作用，TIC已成为目前肿瘤研究的热点。但在肿瘤细胞群落中，TIC数目稀少，培养相对不稳定，因此发展高效的体外培养系统细胞扩增技术以及维持干细胞未分化状态技术已经成为现今研究的重要任务。 

TIC的研究材料主要来自3个方面：患者的肿瘤标本、肿瘤细胞株及肿瘤移植瘤。由于肿瘤细胞株容易获得和培养，目前许多研究者使用细胞株作为TIC研究的重要材料，用以研究TIC调节通路，为临床治疗提供靶点。但肿瘤细胞株能否保持原代肿瘤的等级结构一直遭到质疑。通过体外实验得到的TIC表面标记或调节通路上的调节分子或基因，最终都要通过体内试验再进行验证。以肿瘤移植瘤作为TIC的研究材料的方法则很大程度上解决了这种一致性的问题。异体移植肿瘤是将来自于临床的肿瘤标本接入裸鼠皮下使其长出实体瘤，再将长出的实体瘤继续接种裸鼠在裸鼠体内传代。实体瘤在裸鼠体内传代次数越多，越容易在短时间内建立肿瘤细胞系。经过异体移植而得到的瘤块组织在体外进行单细胞悬液的制备，再将制备的单细胞进一步的分离培养从而获得TIC。虽然原代肿瘤免疫缺陷小鼠的异体移植会改变干细胞的生存环境，但使用这种方法得到的TIC仍是最接近体内真实状态的TIC。 

发明内容

专利的研究目的：胃癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，其死亡率在全世界癌症死亡率中排名第二。虽然不断有文献报道肿瘤干细胞广泛存在于各种实体瘤内，但目前对胃癌干细胞的研究却为数甚少。由于肿瘤干细胞在肿瘤研究和治疗上的重要意义，我们使用异源移植裸鼠的实体瘤块进行了胃癌干细胞的分离和纯化培养。 

专利的研究结果：本发明通过对病人胃癌组织异源移植小鼠瘤块在体外的原代细胞培养、肿瘤克隆形成实验和无血清细胞培养获得了肿瘤干细胞株GAM-016S。该细胞株可在无血清培养条件下形成克隆球；流式细胞检测(FACS)和免疫组织化学(IHC)分析结果显示GAM-016S细胞系表达肿瘤干细胞标志分子CD24、CD44，但不表达CD133；裸鼠腹腔注射100个克隆球细胞即可形成瘤块。 

专利的研究意义：人胃癌肿瘤干细胞株GAM-016S的分离建系，可以实现对肿瘤干细胞的大规模培养，进而建立相应完善的药物筛选平台。由于肿瘤干细胞重要的生物学作用，GAM-016S细胞株的建立对探索TIC生物学行为的分子机制、筛选研发胃癌治疗新药以及胃癌的肿瘤临床研究治疗都具有十分重要的理论意义和实用价值。 

附图说明

图1：GAM-016S克隆形成分析A.无血清培养基B.琼脂培养基 

图2：GAM-016S干细胞标志分子的FACS和IHC分析 

图3：GAM-016S体内致瘤能力分析 

具体实施方式

将来自于临床的胃癌标本皮下接种于B/C雄性裸鼠体内，待长出实体瘤后继续接种裸鼠在裸鼠体内传代。 

将从裸鼠上得到的异体移植肿瘤组织进行胰酶消化分散制成单细胞悬液，再通过原代细胞培养、肿瘤克隆形成实验和无血清干细胞培养技术分离建立胃癌干细胞。 

1.肿瘤干细胞培养：将异体移植的瘤块进行剪切并使用胰酶消化得到单细胞悬液；将获得的单细胞悬液培养在含有EGF、FGF-2的无血清培养基中；使用低粘附性的培养皿进行培养以降低细胞的粘附力并支持低分化的肿瘤细胞团的生长。细胞培养过程中每隔一周更换一次含培养因子的培养液，直到细胞开始形成悬浮的细胞团为止。 

2.肿瘤克隆形成实验：制备0.5％的琼脂糖凝胶培养基(1∶1琼脂糖/培养液)，均匀地平铺于培养皿底层制备培养基层。将无血清培养形成的肿瘤细胞团分离成单细胞悬液，计数并用1∶1琼脂糖/培养液重悬，铺于培养基层。将培养皿其置于5％CO₂、37℃的湿润条件下培养。 

3.流式细胞检测(FACS)和免疫组织化学检测(IHC)：将肿瘤克隆细胞团制备成单细胞悬液，清洗并与相应的抗体(CD24、CD44、CD133)孵育进行FACS检测。IHC检测需要固定石蜡包埋制片脱片制备标本，再将样品标本进行抗体孵育检测。 

4.体内致瘤实验：将肿瘤克隆细胞团制备成单细胞悬液，计数并重悬于1∶1PBS/Matrigel中，将不同数量的细胞皮下接种于BALB/C裸鼠以观察致瘤性。 GAM-016S保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)；保藏日期为2011年12月9日；保藏编号：CGMCC No.5572；分类命名：人胃癌干细胞。