[发明专利]新城疫病毒高粘膜免疫水平弱毒疫苗株NDV/LX及反向遗传构建系统

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学技术和免疫学技术，筛选一株能同时在消化道和呼吸道产生高水平粘膜免疫的基因I型新城疫病毒弱毒株NDV/LX，用于制造疫苗。

背景技术

新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)是严重危害世界养禽业的重要传染性病原体之一，可以感染多种禽类，常导致养禽业产生巨大的经济损失[Alexander，D.J.2001.GordonMemorial Lecture.Newcastle disease.Br Poult Sci 42：5-22.]。该病毒属于副粘病毒科、副粘病毒亚科、禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)的成员[Mayo，M.A.2002.Virus taxonomy-Houston 2002.Arch Virol 147：1071-1076.]。新城疫病毒有囊膜，基因组为单股、负链、不分节段的RNA病毒，基因组结构模式为：3′-NP-P-M-F-HN-L-5′，依次编码6种结构蛋白：核衣壳蛋白(NP)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、融合蛋白(F)、血凝素-神经氨酸酶蛋白(HN)和大分子蛋白(L)即核蛋白(NP)，P，M，F，HN和L蛋白。

根据对鸡的毒力，NDV毒株可以为强毒(Velogenic)、中等毒力(mesogenic)和弱毒(Lentogen)。已开展广泛的试验来阐明病毒致病性的分子决定因素[Huang Z，KrishnamurthyS，Panda A，Samal SK.Newcastle disease virus V protein is associated with viral pathogenesis andfunctions as an alpha interferon antagonist.Journal of virology 2003 Aug；77(16)：8676-85.]。大部分研究是关于F和HN蛋白对致病性的作用，研究结果一致认为F蛋白裂解位点处的氨基酸序列是病毒毒力的主要决定因素[Seal BS.Nucleotide and predicted amino acid sequence analysisof the fusion protein and hemagglutinin-neuraminidase protein genes among Newcastle diseasevirus isolates.Phylogenetic relationships among the Paramyxovirinae based on attachmentglycoprotein sequences.Funct Integr Genomics 2004Oct；4(4)：246-57.]。NDV毒力差异的分子基础主要决定于F0蛋白的蛋白酶裂解位点的氨基酸序列，强毒的裂解位点有聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112GR/K-R-Q-K/R-R-F117；弱毒的裂解位点则缺少聚碱性氨基酸序列，其模式基序为112-E/G-R/K-Q-E/G-R-L117。

自1926年发现新城疫(ND)以来，ND已发生了四次大的流行，而且每一次流行都有不同基因型的毒株出现，尤其是90年代之后出现了新的基因VII型NDV，给我国的养禽业造成了巨大的经济损失。在控制疫病的过程中，使用疫苗是最有效最经济的方法，新城疫的疫苗已使用了几十年，由于ND疫苗的广泛使用，此病已基本上得到了较好的控制，但是临床上非典型ND的发生十分普遍，ND仍然成为威胁养禽业的主要疾病之一，也就是说，常规的疫苗对于NDV强毒的攻击并不能提供理想的保护。从近十年来的ND流行特点来看，临床上所分离到的NDV毒株大多数属于基因VII型[Liu，X.F.，H.Q.Wan，X.X.Ni，Y.T.Wu，and W.B.Liu.Pathotypical and genotypical characterization of strain of Newcastle disease isolatedfrom outbreaks in chicken and goose flocks in some regions of China during 1985-2001.ArchivesofVirology，2003，148(7)：1387-1403.]，而常规的ND疫苗株的基因型主要为I和II型(如V4、La Sota等)，因此，在遗传距离上当前NDV分离株与常规ND疫苗株相差较远。