[发明专利]用以检测突变的方法与引物组

说明书

(1)技术领域

本发明是关于用以检测变异的方法与引物组。具体来说，本发明是关于插入和/或缺失变异的检测。

(2)背景技术

基因突变(gene mutation)系指一特定基因或调控序列的核苷酸序列相较于天然(或正常)核苷酸序列有所改变。突变可以是点突变(point mutation；即，单一核苷酸置换)、一或多个核苷酸的缺失(deletion)或插入(insertion)、多个核苷酸的置换(substitution)或在染色体层级的互换(crossing-over)。

近年来，用以检测点突变或染色体互换的技术发展迅速。举例来说，可利用桑格式直接测序法(Sanger’s direct sequencing)来对目标序列测序，以得知发生突变的一或多个核苷酸。然而此种直接测序的灵敏度不高，因而限制了此技术在临床与研究领域等的应用。或者是可采用专一的引物和/或探针，以正向检测目标序列上的点突变或互换。然而，运用上述方法来检测插入突变与缺失突变的相关报导并不多见。传统上，在设计用以检测插入/缺失突变的引物或探针时，必须先知道突变部位的序列。当目标基因中带有超过一个的插入和/或缺失核苷酸时，必须使用多个引物才能确保所有突变序列都能被检测。此外，传统方法极易发生检测错误，部分是因为以引物或探针和目标基因进行杂交(hybridization)时，突变部位可能形成环圈(looped out)，因此引物或探针仍可和具有突变核苷酸之目标基因发生非特异性的杂交(unspecific hybridization)。更有甚者，这些习知检测方法之检测灵敏度(detection sensitivity)通常较低，因而需要使用大量的脱氧核糖核酸(deoxyribonucleic acid，简称DNA)和/或经过更多次的反应循环，使得整个反应耗时费力。在某些情形中，必须使用实时定量聚合酶链式反应(real-time quantitative polymerase chain reaction，简称RTQ-PCR)和/或RTQ-PCR专用的设备才能够进行检测。因而，为了确保得到正确的检测结果，习知方法可能需要花费较多时间或成本来优化反应参数。以上种种因素限制了这些技术在临床试验以及基础研究等领域的应用。

有鉴于上述问题，相关领亟需提出一种能够正确地检测插入和/或缺失突变的方法。

(3)发明内容

发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。发明内容旨在提供本揭示内容的简化摘要，以使阅读者对本揭示内容具备基本的理解。此发明内容并非本揭示内容的完整概述，且其用意并非在指出本发明实施例的重要/关键组件或界定本发明的范围。

本发明至少部分是基于一种新颖的引物设计方案，此种设计方案使得样本中，带有变体序列(相较于参考序列)的目标基因能够被扩增，且因而能够检测到此种具有突变的目标基因。具体来说，所述目标基因具有模板链以及和此模板链互补的编码链，而本发明提出的引物组及方法是针对该模板链中一段选定区域来进行设计。此处所述的选定区域可能带有或不带有至少一变异核苷酸，此变异核苷酸可能是被插入到参考核苷酸序列中，或自参考核苷酸序列中被移除。于一实施例中，参考序列可为野生型(正常)序列，此时变体序列可带有插入和/或缺失突变。或者是，参考序列可以是一种已知的突变序列，此时所谓的变体序列可以是野生型序列或任何其它突变序列。

有鉴于此，本发明的第一方面是关于根据此引物设计方案的引物组。当可注意到，在根据此种方案设计特定引物组时，不需要事先知道经插入或删除之序列(相对于参考序列)；不过，本发明当然亦可用来检测已知的变体序列。相对应地，此处所教示的单一种引物组能够检测位于选定区域内的多种变异。因而，在本说明书中有时亦会将此处提出的能够扩增这些突变序列的方法称为通用插入/缺失聚合酶链式反应(universal insertion/deletion PCR，Unidel-PCR)或简称为“PCR”。