[发明专利]甘油发酵为有机酸

说明书

技术领域

本专利申请涉及通过使用遗传改造的微生物的发酵从甘油产生有机酸。

背景技术

已经建立大规模的工艺并在商业上用于将脂肪酸的甘油酯（又称作甘油酯、单甘油酯、甘油二酯和甘油三酯）转变为甲醇、乙醇或其他醇的甘油酯。所产生的脂肪酸酯（脂肪酸甲酯又称作FAME，脂肪酸乙酯又称作FAEE）通常称作“生物柴油”，这是因为它们自身或与常规烃类的混合物可用作柴油发动机的燃料。用于所述生物柴油合成的原材料可包括植物油、动物脂肪和丢弃的烹饪油。生物柴油工艺主要体积的副产品是甘油（又称作丙三醇（glycerin或glycerine））。对于产生的每千克生物柴油，产生大约0.1千克的甘油副产品。

当用于生物柴油合成的催化剂是氢氧化钠或者氢氧化钾时，甘油副产品通常是以重量计约80%至90%的甘油，副产品的剩余部分主要是水、甲醇或乙醇（取决于哪种醇被用于酯基转移反应）、多种盐和低水平的其他有机化合物。未处理的甘油副产品是碱性的和粘稠的，因此通常用硫酸、盐酸或其他酸将其中和至pH降至约4或5，这降低了粘性并出现所产生的盐如氯化钠、硫酸钠、氯化钾、硫酸钾等，其确切的组成显然取决于过程中所使用的化合物。通过蒸馏通常能从粗甘油中除去并回收大部分或者全部的醇。在这一类过程中使用的氢氧化钠或氢氧化钾催化剂被称为均相催化剂。

另一种产生生物柴油的过程依赖于“多相催化剂”。这种催化剂的一个例子被称为Esterfip-H，由法国公司Axens商业化。该催化剂的确切特征是专有的，但据报道其是两种非贵金属的尖晶石混合氧化物，且据报道其产生比均相催化剂的甘油副产品纯净得多的甘油副产品。据报道，多相催化剂的甘油副产品的纯度为98%且不含盐（Ondrey，2004）。

随着生物柴油行业的发展，甘油副产品的体积必然平行增长。来自生物柴油工业的粗甘油副产品中的一些通过蒸馏被纯化，并被用于多种已经传统使用甘油作为原料的工业中，而来自生物柴油工业的甘油的剩余部分被认为是烦累的废品。结果，在近几年粗甘油的价格已经直降至0.05美元/磅或更低（De Guzman，2010）。因此，甘油已经成为糖和其他碳水化合物如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉和菊粉的潜在的廉价替代品，作为用于产生燃料和化学品的发酵原料（Clomburg和Gonzalez，2010；Yazdani和Gonzalez，2007）。在本文撰写之时，葡萄糖和蔗糖的价格约为0.15美元至0.25美元/磅，因此，可用甘油代替其他糖的发酵过程可带来实质性的经济优势。

已经开发出许多微生物，用于通过使用可再生糖的发酵商业产生有用化学品。能够使用多种糖作为碳源以显著量产生有机酸的大肠杆菌（E.coli）菌株在本领域是熟知的。例如，美国专利申请公开号2009/0148914提供大肠杆菌菌株作为生物催化剂用于产生化学纯的乙酸盐和/或丙酮酸盐。美国专利号7,629,162提供了为产生乳酸而构建的大肠杆菌KO11菌株的衍生物。在专利合作条约下公布的国际专利申请号WO2008/115958和WO2010/115067提供了经改造以在含有葡萄糖作为碳源的基本盐培养基中以pH受控制的分批发酵法产生琥珀酸盐和苹果酸盐的微生物。美国专利U.S.7,241,594和U.S.7,470,530以及国际专利申请公布号WO2009/024294提供了在使用糖作为碳源发酵产生琥珀酸中有用的瘤胃细菌产琥珀酸曼氏溶血杆菌（mannheimia succiniproducens）。美国专利号5,000,000、5,028,539和5,424,202提供了用于产生乙醇的大肠杆菌菌株。美国专利号5,482,846、5,916,787和6,849,434提供了用于产生乙醇的革兰氏阳性微生物。美国专利号7,098,009提供了用于产生L（+）乳酸的杆菌属（Bacillus）菌株。美国专利号7,223,567、7,244,610、7,262,046和7,790,416提供了用于产生琥珀酸的大肠杆菌菌株。

目前在生物技术工业中使用的用于产生燃料和化学品的大多数微生物都具有用于甘油利用的专用代谢途径。然而，这些工业微生物均未曾显示出具有以对商业化生产有吸引力的生产参数使用甘油作为原料的能力。工业微生物的这种在有用化学品制造中利用甘油作为商业原料的无能归因于在微生物细胞内起作用的某些调节代谢反馈控制机制。