[发明专利]使用改进的溶剂-清洁剂方法进行病毒灭活

说明书

M·费尔根豪尔、M·法尔西特、D·米松、F·蒙唐东

优先权要求

本专利申请依据美国法典第35章第§119(e)条要求于2010年12月15日申请的美国临时专利申请系列号No.61/423,512的优先权，在此通过引用将其全部内容并入本文。

技术领域

本申请说明书涉及在蛋白质制造期间灭活病毒污染物的方法。

背景技术

作为治疗许多影响个体健康的疾病、紊乱、或状况的方法，使用包含治疗性蛋白质的药物组合物的重要性一直在提高。许多在药物组合物中使用的蛋白质典型地是通过使用哺乳动物细胞系进行重组体生产、或者通过从生物液体中提纯而获得的。然而，通过这些方法制造的治疗性蛋白质可能会被对个体健康有害的传染性病原病毒污染。因此，重要的是加工治疗性蛋白质以便消除任何污染性病毒的活性、借此确保得到的药物组合物给药于个体是安全的。

当前有许多不同的用于灭活传染性病原病毒的方法，包括，例如加热灭活、溶剂/清洁剂(S/D)灭活、pH灭活、化合物灭活、和/或紫外线照射灭活。在这些方法中，S/D灭活或许是最为广泛接受的杀病毒方法，因为几乎所有重要的人类病原体都是包膜病毒，其对于通过溶剂和清洁剂破裂细胞膜是敏感的。另外，当与其他的杀病毒方法相比时，S/D方法可更好地保持被治疗的液体的含量和生物活性。例如，采用加热、酸性pH、化合物和辐射的灭活方法存在一些问题，因为这些试剂是刺激性的和/或侵袭性的，并且倾向于使待纯化的治疗性蛋白质变性、或者另外失去活性。

在S/D灭活方法中，将有机溶剂和清洁剂与包括被纯化蛋白质的液体混合，并且保温。该溶剂可产生促进在清洁剂和包封病毒的类脂膜之间聚集的环境，并且清洁剂可破坏在该类脂膜中分子之间的相互作用。一旦被破坏，包膜病毒就不再能结合并感染细胞，并且不能再生，因为完整的类脂膜对这些活性而言是必不可少的。该灭活一般在超过20℃的温度下进行，因为较高的温度可促进包膜的破裂。例如，根据世界卫生组织(WHO)指南使用的典型状况是0.3％磷酸三(正丁)酯(TNBP)和1％聚山梨酸酯80单油酸山梨醇酐酯在24℃下保温至少6小时、或者0.3％TNBP和1％聚氧乙烯辛基苯基醚(TRITONX-100)在24℃下保温至少4小时。参见，例如，WHO技术报告，附录4，“病毒灭活和去除工序以便保障人类血浆产物的病毒安全性”指南，档案号924，第151-224页，(2004)。

溶剂/清洁剂混合物保温至超过20℃的温度具有几个缺陷。首先，在较高的温度下灭活是费时的，因为预热混合物至温度高于20℃会增加给总加工时间大约2至大约6个小时。其次，在该较高的温度下保温、连同促进均匀加热所必需的搅拌会增强蛋白质聚集形成，导致有用的蛋白质的产率和/或活性下降。暴露于高于20℃的温度也会增加蛋白质对降解的敏感性。本申请说明书公开了一种新颖的用于灭活来自样品的传染性病原病毒的S/D方法，其可克服这些缺陷。在此公开的方法使用低于两个小时的保温时间，并且保温温度低于20℃。减少保温时间可减少加工和/或制造蛋白质所必需的总体时间，所述蛋白质是通过重组体生产或者生物液体提纯而获得的。另外，减少时间并且降低温度可通过降低蛋白质对聚集和降解的敏感性而导致提高的蛋白质产率。

发明内容

因此，本申请说明书的一些方面公开了灭活含有脂质外套的病毒的方法，该方法包括下述步骤：a)提供包含具有活性的蛋白质的液体；b)将有机溶剂和表面活性剂与该液体相混合，借此产生混合物；以及c)将该混合物保温至多大约120分钟；其中两个步骤(b)和(c)在不高于大约20℃的温度下进行；其中混合物在保温后基本上不含活的含有脂质外套的病毒；并且其中所述蛋白质在保温后的活性为步骤(a)中所提供活性的至少25％。该液体可能是细胞裂解液、细胞上清液、来自在前提纯步骤的洗脱液、或者生物液体。该蛋白质可以通过使用细胞系进行重组体生产、或者通过从生物液体中提纯而得到。有机溶剂可以是醚、醇、或者烷基磷酸酯比如磷酸二烷基酯或磷酸三烷基酯。表面活性剂可以是离子型表面活性剂比如阴离子表面活性剂或者阳离子表面活性剂、两性离子型(两性)表面活性剂、或者非离子型表面活性剂。该方法可以、或者可以不进一步包括在步骤(c)之后从混合物中除去溶剂、表面活性剂和/或非存活病毒的步骤。