[发明专利]介导肿瘤细胞裂解的双特异性适体

说明书

适体是可以结合几乎所有种类的分子的单链DNA或RNA寡核苷酸。它们的确定和刚性三级结构允许多种靶的特异性和高亲和分子识别。它们可以从长度15到85个核苷酸不等，导致5-25 kDa的表观分子量。

适体通过对分离的重组蛋白质（“过滤SELEX”）或全细胞（“细胞SELEX”）选择的称为SELEX的过程发现。

几个特征提供适体超过抗体和其他基于蛋白质的形式的特定竞争优势：

- 免疫原性的假定不存在。当以动物和人治疗应用中使用的剂量大1000倍的临床前剂量施用时，适体展示低免疫原性至无免疫原性。许多单克隆抗体的功效可以被针对抗体自身的免疫应答受到严重限制，但非常难以引发针对适体的抗体，最可能是因为适体不能通过MHC由T细胞提呈，并且免疫应答一般未训练为识别细胞外核酸。?

- 通过化学合成以高精确度和再现性的容易和公认的成本有效的生产。预期在不同生产费用之间没有变动。它们通过严格、变性条件纯化，确保极高纯度。?

- 可达到高亲和力和选择性。治疗适体是化学上强壮的。通过热或变性剂变性的适体固有地容易地在数分钟内再生，并且可以作为冻干粉末在室温贮存高达一年的延长时段，从而显示出极高的保存期限。当修饰时，是热和核酸酶抗性的。?

- 良好的可溶性（>150 mg/mL）和相对低的分子量（适体：10-50 kDa相对抗体：150 kDa）。

SELEX?方法

用于生成适体的合适方法是图2概括所述的名称为“通过指数富集的配体系统进化”（“SELEX?”）的过程。SELEX?过程是与靶分子高特异性结合的核酸分子的体外进化的方法，并且在例如于1990年6月11日提交、现在放弃的美国专利申请序列号07/536,428、名称为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,475,096，和名称为“Nucleic Acid Ligands”的美国专利号5,270,163（还参见WO 91/19813）中描述。每种SELEX?鉴定的核酸配体即每种适体是给定靶化合物或分子的特异性配体。SELEX?过程基于下述独特理解：核酸具有足够用于形成多种二和三维结构的能力和在其单体内可获得的足够化学多样性，以充当基本上任何化学化合物（无论是单体还是聚合的）的配体（即形成特异性结合对）。任何大小或组成的分子都可以充当靶。

SELEX?依赖包含随机化序列的单链寡核苷酸的大文库或库作为起点。寡核苷酸可以是修饰或未修饰的DNA、RNA或DNA／RNA杂交物。在一些例子中，该库包含100%随机或部分随机的寡核苷酸。在其他例子中，该库包含含有掺入随机化序列内的至少一个固定和／或保守序列的随机或部分随机的寡核苷酸。在其他例子中，该库包含在其5'和／或3'末端含有至少一个固定和／或保守序列的随机或部分随机的寡核苷酸，所述至少一个固定和／或保守序列可以包含由寡核苷酸库的所有分子共享的序列。固定序列是这样的序列，例如PCR引物的杂交位点、RNA聚合酶的启动子序列（例如T3、T4、T7和SP6）、限制位点、或同聚序列例如聚A或聚T束、催化核心、与亲和柱选择性结合的位点、和促进目的寡核苷酸克隆和／或测序的其他序列。保守序列是由与相同靶结合的许多适体共享的除了先前描述的固定序列外的序列。

该库的寡核苷酸优选包括随机化序列部分以及有效扩增所需的固定序列。一般地，起始库的寡核苷酸含有固定的5'和3'末端序列，其侧接30-50个随机核苷酸的内部区域。随机化核苷酸可以以许多方式产生，包括化学合成和来自随机切割的细胞核酸的大小选择。在测试核酸中的序列变动还可以通过在选择／扩增迭代（iterations）前或过程中通过诱变引入或增加。