[发明专利]目标核酸多标靶定量鉴定

说明书

相关申请的交叉参考

本申请要求美国临时专利申请编号为61/393.253的优先权，题为“多标靶定量”，于2010年10月14日提交，所有内容纳入本参考中。

发明背景

1.发明适用领域

本发明涉及分子检测，更具体地来说，是关于一个或众多目标分子多标靶定量检测的方法和系统。

2.发明背景

生化分析一般用于研究、临床、环境和工业设置，以检测和量化某些基因序列、抗原、疾病或病原体。生化分析通常用来识别生物体，比如宿主生物体或样品中的寄生虫、真菌、细菌或病毒。在特定条件下，生化分析可以提供定量检测，其可以用来计算感染或疾病的程度，并且监测疾病随着时间的推移而产生的状态。一般情况下，生化分析通常检测从研究、临床、环境或工业来源样品中所提取的抗原（采用免疫测定法）或核酸（基于核酸或分子的生化分析）。

对生化分析而言，定量识别横跨国土安全、食品安全以及医疗诊断等众多学科的多种病原体需求是不断增长的。虽然现有技术可以进行多种定量分析，但是这些技术无法对多种病原体提供足够的定量识别。例如，微阵列提供满意的DNA多靶标鉴定，但是很少或根本没有提供量化信息。另一方面，实时PCR提供高品质的量化信息，但是多靶标鉴定则有限。

实时聚合酶链反应（PCR），在其它应用中也被称作定量实时聚合酶链反应（qrt-PCR），它是一个分子生物学工具，采用众所周知的PCR工艺来同时扩增目标DNA分子，同时量化目标DNA；与另一个输入相比，可以作为一个绝对量或者一个相对量。采用标准的PCR，可以在反应完成后对产品进行检测。与此相反，为进行定量实时聚合酶链反应，用户采用大致相同的方式来放大目标DNA分子，但是在聚合酶链反应进展的同时来检测目标DNA分子。用来实时检测qrt-PCR产品的一些最常用方法，就是利用结合到双链DNA产品中的非特异性荧光染料；或者使用标有荧光报告基团的特定序列探针，只有当探针与目标序列产生交叉时，荧光报告基团才会发出荧光。如果采用这些方法，则需要提供附加设备比如荧光检测器。

特定序列探针法要求使用的探针具有核苷酸碱基序列，它与目标序列基本上互补，或者与其扩增物交替互补。在选择性生化分析条件下，为了检测样品中目标序列是否存在，探针被用来杂交目标序列或其扩增物。有效的探针可以防止与任何核酸序列进行非特异性杂交，这些核酸序列会干扰检测是否存在目标序列。探针或扩增物可包括标记物，能够检测标记所在位置，比如放射性标记、荧光染料、生物素、酶、电化学或化学发光化合物等。

为量化qrt-PCR产品，将所检测到的荧光强度绘制在对应于PCR循环数的对数刻度图上。可以通过比较试验结果和采用已知量产品获得标准结果来决定待反应中的目标量。然而，这只是可以量化qrt-PCR产品的方式之一。

定量实时PCR应用很多，特别是在分子生物学方面更是如此。qrt-PCR的一个特别用处在于获取样品中有关病原体的定量信息。为了定量分析，实时测量荧光强度，或者实时测量扩增反应期间扩增物浓度增加的另外一个参数都是必要的。为区分众多靶标，必须为每个靶标设计带有特定探针的特殊引物。或者在一个要求不高的情况下，只需要设计引物以及将诸如SYBR绿色荧光报告物应用于该反应，以监测扩增物的浓度在增加。例如，如果有10个潜在靶标，那么通常情况下需要10个不同的探针。当前最先进的探测器/探针组合允许多靶标同时检测最多4或5个目标。但是，大多数实时PCR系统只配备两个探测器，用于多靶标检测。使用该系统，对于区分6个丙型肝炎C病毒（HCV）基因而言则需要进行6次单独的PCR反应。

DNA微阵列是一种工具，通过样品中目标核酸与微阵列上互补的DNA序列相杂交，以检测样品中是否存在目标核酸序列。微阵列本身含有多达数千个的DNA斑点–被称作探针（或报告物）-其连接到表面上（例如微阵列自身表面或者次表面，比如小珠）。通常在显微镜玻片或其他相对较小的表面上形成微阵列，可以通过微阵列读取器来轻松读取。DNA探针的读取范围可以从很短或很长的DNA片断，并且常常包括一个短的寡核苷酸、基因、基因段、或非编码DNA片段，其中包括许多其它类型的序列。