[发明专利]磷酸化的N-聚糖的脱甘露糖基化

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求2010年9月29日提交的美国申请流水号61/387,924的优先权。在先申请的公开内容通过提述完整并入本文。

发明领域

本发明涉及能在下层甘露糖(underlying mannose)被磷酸化时水解末端α-1,2-甘露糖的alpha-甘露糖苷酶。

发明背景

需要高性能表达系统来生产目前开发下的大多数生物药物(例如，重组蛋白)。许多这些生物药物的生物学活性依赖于其翻译后修饰(例如，磷酸化或糖基化)。基于酵母的表达系统组合具有分泌及修饰蛋白质的能力的微生物生物体容易遗传操作和发酵。然而，酵母细胞中生成的重组糖蛋白展现主要为异质的高甘露糖和超甘露糖聚糖结构，其对于蛋白质功能、下游加工、及随后的治疗性用途，特别地是在糖基化起生物学重要作用的情况中可以是不利的。

发明概述

本文件基于能够在下层甘露糖被磷酸化时水解末端alpha-1,2甘露糖连接或模块(moiety)的甘露糖苷酶的发现。

在一个方面，本文件的特征在于一种用于使糖蛋白上的磷酸化的N-聚糖脱甘露糖基化的方法。该方法包括提供具有磷酸化的N-聚糖的糖蛋白；并使所述糖蛋白与甘露糖苷酶接触，所述甘露糖苷酶能够在下层甘露糖被磷酸化时水解末端alpha-1,2甘露糖连接或模块。甘露糖苷酶可以来自斋藤曲霉(Aspergillus satoi)或纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobium cellulans)。所述方法进一步可以包括分离含有脱甘露糖基化的磷酸化N-聚糖的糖蛋白。蛋白质可以是在真菌生物体中表达的人蛋白质。例如，真菌生物体可以是解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)或Arxula adeninivorans。真菌生物体也可以是甲基营养酵母(例如，巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、Oogataea minuta、或多形汉森酵母(Hansenula polymorpha))或丝状真菌(例如，浅蓝灰曲霉(Aspergillus caesiellus)、亮白曲霉(Aspergillus candidus)、肉色曲霉(Aspergillus carneus)、棒曲霉(Aspergillus clavatus)、弯头曲霉(Aspergillus deflectus)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、烟曲霉(Aspergillus fumigatus)、灰绿曲霉(Aspergillus glaucus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、赭曲霉(Aspergillus ochraceus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)、帚状曲霉(Aspergillus penicilloides)、局限曲霉(Aspergillus restrictus)、酱油曲霉(Aspergillus sojae)、萨氏曲霉(Aspergillus sydowi)、溜曲霉(Aspergillus tamari)、土曲霉(Aspergillus terreus)、焦曲霉(Aspergillus ustus)、或杂色曲霉(Aspergillus versicolor))。蛋白质可以是病原体蛋白质、溶酶体蛋白质、生长因子、细胞因子、趋化因子、抗体或其抗原结合片段、或融合蛋白。例如，溶酶体蛋白质可以是溶酶体酶诸如与溶酶体贮存病(LSD)有关的溶酶体酶。LSD可以是法布里(Fabry)氏病、粘多糖贮积症I、法韦尔(Farber)病、戈谢(Gaucher)病、GM1-神经节苷脂贮积病(gangliosidosis)、泰-萨克斯病(Tay-Sachs disease)、桑德霍夫(Sandhoff)病、GM2激活物病(GM2activator disease)、克拉伯(Krabbe)病、异染性脑白质营养不良(metachromatic leukodystrophy)、尼曼-皮克(Niemann-Pick)病、沙伊(Scheie)病、亨特(Hunter)病、桑菲列普(Sanfilippo)病、莫尔丘(Morquio)病、马-拉(Maroteaux-Lamy)病、透明质酸酶缺乏、天冬氨酰基葡萄糖胺尿(aspartylglucosaminuria)、岩藻糖苷贮积症(fucosidosis)、甘露糖苷贮积症(mannosidosis)、欣德勒(Schindler)病、涎酸贮积症1型、蓬佩(Pompe)病、致密性成骨不全症(Pycnodysostosis)、蜡样脂褐质沉积症(ceroid lipofuscinosis)、胆固醇酯贮积病(cholesterol ester storage disease)、沃尔曼(Wolman)病、多种硫酸酯酶缺乏症(Multiple sulfatase deficiency)、半乳糖涎酸贮积症(galactosialidosis)、粘脂糖症(mucolipidosis)、胱氨酸贮积症(cystinosis)、唾液酸贮积病(sialic acid storage disorder)、乳糜微粒保留病伴马里内斯科-舍格伦综合征(chylomicron retention disease withsyndrome)、赫曼斯基-普德拉克综合征(Hermansky-Pudlak syndrome)、切-东二氏(Chediak-Higashi)综合征、Danon病、或Geleophysic发育异常。