[发明专利]高纯度肝素及其制备方法

说明书

技术领域

本专利申请要求日本专利申请第2010-205310号的优先权，在此将其全部内容引述至本说明书中作为参考。

本发明涉及实质上不含引起副作用的物质、安全性高、作为药品、化妆品及研究试剂等有用的高纯度肝素及其制备方法。

背景技术

肝素是存在于肝、小肠、肺和皮肤等的、含有经硫酸化的D-葡糖胺、D-葡糖醛酸、L-艾杜糖醛酸等的酸性粘多糖。

肝素具有较强的抗凝血活性，除应用于弥散性血管内凝血(DIC)的治疗、各种血栓栓塞症（静脉血栓栓塞症、心肌梗塞、肺栓塞、脑栓塞、四肢动脉血栓栓塞、手术中、手术后的血栓栓塞等）的治疗及预防外，还可在使用血液透析、人工心肺机等体外循环装置时或插入血管导管时，或是在输血及血液检查等场合下用来防止血液凝固。

此外，公知肝素除了具有抗凝血活性外，还具有脂蛋白脂肪酶活化作用、抗血小板凝集作用、降血压作用、抗补体作用、抑制癌症转移作用、抑制肥大细胞脱颗粒的作用、抑制局部炎症、镇痛以及促进肌肉组织的血液循环等多种生理活性。

肝素主要是从健康的供食用动物的组织中提取/分级来制造的，但从BSE（牛海绵状脑病）问题出现后，作为药物的肝素的来源则基本为猪的小肠粘膜。通常，将猪小肠粘膜悬浮于水类溶剂中进行蛋白质消化，然后加入吸附剂等（非专利文献1），以复合物的形式将肝素及其他粘多糖（主要是硫酸软骨素系列、硫酸乙酰肝素等）提取，将其作为粗原料。接着再对其进行批量混合/分级，得到肝素（所谓的“未分级肝素”）。

用上述方法所得到的肝素（未分级肝素）含有除肝素外的粘多糖（主要是硫酸乙酰肝素、硫酸软骨素B及硫酸软骨素C），已经知道其含量会随粗原料及制造方法而不同。但是，确认了这种杂质的大致的副作用是可接受的，其结果，在很长一段时间里都将未分级的肝素用作药物。

然而，2008年初在美国和德国报告发生了多起向患者静脉团注（快速静注）未分级的肝素制剂时，出现与以往不同的副作用的病例，最终演变成超过80人死亡的事件。美国FDA对这种未分级的肝素制剂及其原料药进行了分析，结果确认了其与一直以来所使用的产品存在明显差异，进一步地确认到了这种产品中存在过硫酸化硫酸软骨素（Over sulfated chondroitin sulfate：OSCS）(非专利文献2~4)。这种物质是自然界中不存在的物质，据说很可能是在制造原料药时混入的。

日本国内虽然没有重度副作用的报告，但也回收了部分未分级的肝素制剂及低分子肝素（Low molecular weight heparin：LMWH）制剂，向市场稳定供应的问题变得严峻。

许多研究人员根据OSCS的科学合成法、结构解析或动物实验等来探明有害现象的原因，特别是还根据1H-NMR和其他试验方法等对纯度及安全性的确认进行了研究（非专利文献5和6），确认OSCS为造成日本国内有害现象的原因物质，确认/纯度实验的研究通过行政、制剂制造商来实施（非专利文献7和8）。

另一方面，作为肝素的制造或者纯化方法，公知有1）非专利文献1、2）非专利文献9、3）非专利文献10和4）专利文献1等中记载的方法。

但是，能够简便且有效地从肝素中除去OSCS、硫酸软骨素等杂质的方法，至今为止还是未知的。进一步地，简便地检出或测定上述肝素中杂质的方法至今为止是未知的。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Roden，L.，Dorfman，A.，Acta Chemi.Scand.13，2121（1959）

非专利文献2：Nature Biotechnology，2008，26，669-675

非专利文献3：The New England Journal of Medicine，2008，359，2674-2684

非专利文献4：The New England Journal of Medicine，2008，358，2457-2467

非专利文献5：Beyer，T.et al.，Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，48，13-19(2008)

非专利文献6：Guerrini，M.et al.，Nature Biotechnology26，669-675(2008)

非专利文献7：橋井則貴ら、医药研究39(10)651-659(2008)

非专利文献8：Jia，H.，Nature Biotechnology26，477-478(2008)