[发明专利]用于蛋白表达的细胞培养基和方法，所述培养基和方法包括一种PAM抑制剂

说明书

技术领域

本发明涉及包含PAM抑制剂或其生理等同物的细胞培养基和培养方法。

背景技术

虽然蛋白质的主要特征是它们的氨基酸序列（一级结构），其它方面，如转译后修饰，也贡献蛋白质的一些特性，影响二级，三级和四级结构。一些转译后修饰对后期蛋白质活性发挥了显著作用，包括生物药品的安全性和有效性。

蛋白质异质性的一个主要方面是电荷分布，其包括酸性变种，例如通过氨基酸如天冬酰胺的脱酰胺化，通过糖基化或通过N-末端谷氨酰胺到焦谷氨酸，以及基本的变种的处理，及例如，C-末端赖氨酸的变体和酰胺化的氨基酸，特别是C-末端脯氨酸酰胺残基以形成。

C-末端脯氨酸酰胺残基的形成，在某些情况下，然而，是不需要的，例如，如不希望的异质性的来源，或所述变种潜在影响蛋白质的活性或免疫原性的情况下，或当酰胺化氨基酸的量，如脯氨酸酰胺，在蛋白质里相对参考蛋白质被生产的过高或过低。

相对于在高度可控的物理化学条件下生产的小分子药物，蛋白质的生产，特别是用作生物治疗药物的蛋白质的生产，是一个非常复杂的问题，是很难控制的，因为生产利用活细胞培养系统。因此，重要的是手边有一个工具箱，允许控制，特别是生产蛋白质的转译后修改，为了能够提供稳定的产品质量和稳定的高产出率，提高生产过程的效率，增加，和/或微调生产的蛋白质的生理活性和派生药物的安全，和/或匹配生产蛋白质和参考蛋白质的转译后特性。

本发明的目的是提供一种用于蛋白质表达的方法和培养基来满足这些要求。

这些目的是通过根据本发明的独立权利要求的方法和手段来满足。从属权利要求与优选的实施例相关。应当理解的是被数值界定的数值范围被理解为包括所述端点值。

发明内容

在本发明被仔细描述前，应当理解，本发明并不局限于描述装置的特定部件或描述方法的步骤，因为这些装置和方法可能改变。也应当理解的是，本发明所用的术语目的只是描述特定的实施例，并不意在对其进行限制。必须指出的是，用在说明书和附属权利要求中的单数形式“一”，“一个”和“该”包括单数和/或复数对象，除非上下文中另有明确规定。而且应当理解的是，如果参数范围被给定，通过数值来界定，该范围被视为包括这些端点值。

根据本发明的第一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养基，该培养基包括一种PAM抑制剂或其生理等同物。根据本发明的另一方面，提供一种用于蛋白质表达的细胞培养方法，在该方法中，一种PAM抑制剂或生理等同物被使用。

PAM（肽α-酰胺单加氧酶）是一种多功能蛋白，其含有两个顺序作用的酶的活性来催化C-末端截断和α-酰胺化的肽。肽α羟基化单加氧酶（PHM）催化该反应的第一步，并依赖于铜（Cu）或铜离子，抗坏血酸盐和分子氧。依赖锌的肽基酰氨基甘醇酸酯裂解酶（PAL）催化该反应的第二步骤，酰胺化的C-末端脯氨酸酰胺。

PAM抑制剂是降低PAM复合物催化率的物质。Chew（2003）表明PAM抑制剂可能是有用的抗增殖药物，而Bauer等（2007）表明，一些PAM抑制剂具有抗炎作用。然而，到目前为止，在细胞培养基或培养方法中使用PAM抑制剂，特别在基因表达中，更特别在异源蛋白质的表达中没有被描述。

PAM抑制剂的一些例子，在下面的表中提到：

·S-（硫代苯甲酰基）巯基乙酸

·N-（苯硫基乙酰基）丙氨酸

·S-（4-甲硫基苯甲酰）巯基乙酸

·4-氰基-4-甲基-4-硫代苯甲酰基-硫烷基丁酸

·S-（4-甲硫基苯甲酰）巯基乙酸乙基酯

·S-（N-苯氨基硫甲酰基）-3-巯基丙酸

·S-（苯基硫代乙酰基）巯基乙酸

·S-（N-苯氨基硫甲酰基）巯基乙酸

·S-（3-苯硫基丙酰基）巯基乙酸

·N-羟基酸苯基氨基甲酸乙酯

·（D，L）-四氢噻吩

·（苯硫基）乙酸

·（2-硝基苯硫基）乙酸

·S-（月桂硫代）巯基

·双硫仑

·亚硫酸钠

·4-苯基-3-丁烯酸（PBA）

·硫普罗宁

·卡托普利

·EDTA

·亚硫酸铵

·氢化肉桂-苯丙氨酰基-高半胱氨酸

如上所述，上述PAM抑制剂的生理等同物也被本发明包括。

在本发明的一个优选实施例，上述表达式一个异源蛋白质的表达。