[发明专利]2,4-二羟基丁酸的生产方法

说明书

本发明涉及通过使用合成途径从苹果酸生产2,4-二羟基丁酸的新方法，合成途径包含分别具有苹果酸激酶，苹果酸半醛脱氢酶，和2,4-二羟基丁酸脱氢酶活性的酶。

本申请中引用的羧酸在其盐（如2,4-二羟基丁酸盐）或酸（如2,4-二羟基丁酸）形式下是等同命名的。

2,4-二羟基丁酸（等同2,4-DHB或DHB）是有相当经济效益的化合物。通过调整适合的pH，可以在水介质中容易地将DHB转化为α-羟基-γ-丁内酯。α-羟基-γ-丁内酯是生产在动物营养中有很大市场的甲硫氨酸物2-羟基-4-（甲硫基）-丁酸（HMTB）的重要前体（Deck et al.,2008）。目前，α-羟基-γ-丁内酯通过包含γ-丁内酯在α位置的卤化，并随后在碱性介质中以羟基替代卤素原子的多阶段反应衍生自γ-丁内酯（Deck et al.,2008）。

由于油价的增长，从可再生资源生产DHB的需要升高。微生物能够将源自生物质的原料，如糖或有机酸，转化为大量各种不同的化学化合物（Werpy&Petersen，2004）。随着生物化学和基因组学信息量的增长，可以修饰微生物以使其能以高产量和产率过量生产天然发生的代谢中间体（Bailey,1991）。生产微生物的优化经常需要合理的代谢网络工程，这确保其中目标代谢物的生物合成所需的酶过量表达，并减轻产物的反馈抑制。另外的可能性是使用能催化目标代谢物生产的新酶系统。

代谢工程方法和酶催化需要生化和产生目标代谢物的代谢途径调节方面的详细知识。在生产DHB的情况下，这些信息是无法获得的。仅有少量研究报道了琥珀酸半醛脱氢酶缺乏症患者中的DHB发生（Shinka et al.2002），然而没有确定DHB生产中涉及的酶反应。因此，DHB的发酵或酶生产需要（i）确定能将易得到的前体转化为DHB的热力学可行途径，（ii）确定或构建途径中能够催化各反应步骤的酶和（iii）在适合的生物生产中，途径酶的功能表达。

本发明目的是为满足这些需求。

因此，本发明的一个目的是生产2,4-DHB的方法，包括使用苹果酸激酶将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸的第一步骤，使用苹果酸半醛脱氢酶将4-磷酸-苹果酸转化为苹果酸-4-半醛的第二步骤，使用DHB脱氢酶将苹果酸-4-半醛转化为2,4-DHB的第三步骤。

在第一个反应中（见图1（i）），通过具有苹果酸激酶活性的酶的作用，苹果酸（1）被转化为4-磷酸-苹果酸（2）（A）。在第二个反应（B）中，通过具有苹果半醛脱氢酶活性的酶的作用，4-磷酸-苹果酸被转化为苹果酸-4-半醛（3）。更准确地，反应（B）是由在生物合成途径意义中具有脱磷酸4-磷酸-苹果酸还原酶活性的酶来催化。在第三反应（C）中，通过具有DHB脱氢酶活性的酶的作用，苹果酸-4-半醛被转化为DHB。更准确地，反应（C）是由在生物合成途径意义中具有苹果酸-4-半醛还原酶活性的酶来催化。

目前为止在活细胞中既没有描述过也没有确认过上面引用的酶和中间产物。这样苹果酸激酶，苹果酸半醛脱氢酶，DHB脱氢酶和4-磷酸-苹果酸是本发明进一步的目的。

在本发明另外一个方面中，生产2,4-DHB方法的第一步骤包括苹果酸激酶，其特征在于其能将苹果酸转化为4-磷酸-苹果酸。所述酶可以通过酶的至少一个突变获得，所述突变改进了突变酶对苹果酸的活性和/或底物亲和力。

在本发明中，表述“改进活性和/或底物亲和力”意思是突变前的酶，要么是

-不能使用底物（苹果酸，4-磷酸-苹果酸或苹果酸-4-半醛），和/或

-以低于最大特定速率的至少3倍的速率（at a maximum specific rate at least three times lower）来合成反应产物（4-磷酸-苹果酸或苹果酸-4-半醛或DHB），和/或

-对苹果酸，4-磷酸-苹果酸，或苹果酸-4-半醛具有低于至少3倍（at least three times lower）的亲和力，和/或

-对天然底物（天冬氨酸，4-磷酸-天冬氨酸，天冬氨酸-4-半醛）具有高于至少3倍（at least3times higher）的亲和力。