[发明专利]腺病毒组装方法

说明书

相关申请的交叉引用 

本申请要求2010年8月16日提交的美国临时申请61/374,198的权益，为了所有目的，该临时申请全部并入本文。 

发明背景 

有52种人类腺病毒感染不同的人组织，还有上百种腺病毒能够感染从鱼到灵长动物的其他物种。这些病毒是高效的纳米级机器，能够在感染1小时内将它们的遗传物质有效负载至细胞核内。这些DNA病毒不整合到宿主DNA中，利用成熟的GMP方案可以产生高滴度的病毒，而且它们在为了表达异常基因进行的研究和人类基因治疗应用中表现很安全。但是，到目前为止，由于使用几乎只限于一个变种Ad5或Ad2/5嵌合体以及不能快速和系统地构建和组合多个基因修饰，它们的潜在应用受到了局限。因此，需要将常用的腺病毒载体扩展到Ad2/5以外，并且要建立一个技术平台来协助由组成部分快速离体地组装新的腺病毒基因组，以便能够系统地引入多个修饰和异源元件。这样的系统可以利用天然的病毒架构在能够高效运送和表达36个基因(不包括剪接变体)方面的优点。所述系统可以提供有力的诊断剂和治疗剂，这些诊断剂和治疗剂包含对不同肿瘤样品中失去调控的途径活性的多重和定量测量。 

腺病毒载体在多种应用中的潜力受限于快速和系统地操纵36kb病毒基因组的能力。而且，基础研究、动物模型、基因治疗和溶瘤治疗中使用的腺病毒载体只限于腺病毒(Ad)血清型2和5。Ad2和Ad5居于最早发现的腺病毒之列，因此传统上有大量载体/工具来操纵它们的基因组，特别是E1区域。Ad2/5纤维蛋白(Fiber proteins)通过结合受体CAR感染上皮细胞。不幸的是，不是所有类型的细胞都表达CAR，而且CAR在许多转移病例中被下调。再者，接近80%的人口具有预先存在的抗Ad2/5的中和抗体，这与脱靶肝摄取和炎症一起限制了系统性应用。因此，使用Ad2/5载体进行基因递送和癌症治疗不一定是最佳选择，而主要是历史的偶然事件。 

我们的最终目的是建立强力的癌症病毒疗法，所述疗法不仅能够进行肿瘤选择性裂解复制，还可以在多轮治疗中进行系统地给药、避免对肝脏的毒性、有效地靶向和穿越令人苦恼的肿瘤血管、经由不同的受体感染细胞、在肿瘤内通过前药活化酶/毒素的局部表达产生肿瘤旁观者效应并且复苏有益的宿主抗病毒免疫反应。这些主要挑战因为人类腺病毒不能在小鼠中复制而更加严重。这排除了相比异种移植模型有许多优势的在免疫活性癌症基因工程小鼠模型(GEMMs)中进行人溶瘤病毒评价的可能。 

52种人类腺病毒的存在表明腺病毒高度专性适应不同宿主组织环境中的感染和复制。这些病毒中的许多可以感染不同组织，并且含有能够结合除CAR之外的细胞受体的纤维蛋白以及一群不同的‘E3’免疫调节基因。由于缺少修饰它们的基因组所需要的工具，对它们的这些独特属性还没有广泛的研究或利用。类似地，还存在感染其他物种的腺病毒，包括鼠腺病毒(MAV-1)。 

本文提供了对现有技术中的这些和其他问题的解决方案。 

发明概述 

本发明一方面提供了制备重组腺病毒的方法(文中又称为“Adsembly”)。所述方法包括由两个或更多个腺病毒基因模块组装核酸，所述模块选自E1模块、E2-L2模块、L3-L4模块、E3模块、E4模块或者腺病毒大模块(macromodule)(或者如下文描述的突变体)。 

本发明另一方面提供了包含复数个腺病毒基因模块的文库。 

本发明另一方面提供了实施本文提供的方法的试剂盒。 

附图简述 

图1.现有腺病毒载体方法和Adsembly的比较列表。Adsembly克服了现有系统中的多个限制。 

图2.进一步开发腺病毒作为治疗剂所需要克服的挑战。简图表明了该领域需要克服的几个主要问题。 

图3.列举了四种不同腺病毒属的系统发生树。没有列出所有已知腺病毒。该图展示了腺病毒家族中的种类多样性。 

图4.52种已知的人腺病毒的受体和向性。受体和向性在血清型和亚型之间有所不同，因此可以利用这一点来重新靶向某些病毒。