[发明专利]在流式芯片检定中对核酸目标的实时扩增和微阵列检测

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于进行目标多核苷酸分子的快速检测和/或定量的方法。本发明涉及一种结合微阵列和流通式装置的用于快速扩增（优选通过PCR进行）可能存在于溶液中的多个目标多核苷酸分子以及实时定量扩增这些目标物的方法。该方法适用于分子生物学中复杂样品的诊断应用。

本发明还提供简单且不昂贵的设备和仪器，来执行基于经由扩增的实时追踪而快速检测和/或定量多种目标的方法。

背景技术

核酸序列的扩增使用多种扩增反应来进行，在多种扩增反应中，最突出的是聚合酶链式反应（PCR）。PCR是用于扩增特定核酸序列的方法。当实时监测扩增过程时，将PCR用来定量分析。实时PCR通常利用溶液中的荧光报告物质，例如嵌入染料、TaqMan探针、Scorpion引物、分子信标。当在实时PCR中分析多个核酸目标序列时，提议两种方法。第一种是使反应平行化，即，在独立的隔间中进行各自的反应。第二种方法是使反应多重化，即，在相同的隔间中进行反应并对于各种反应使用不同的荧光染料报告物质。这种分析受到能有效分辨的荧光染料数量的限制。现有技术的状态是通常在同一溶液中进行2个、有时候为4个、偶尔6个反应。

近来提出捕捉分子（capture molecule）用于检测在PCR过程中扩增的多核苷酸的用途（WO2006/053770）作为多重实时PCR的第三种替代方法。该方法基于光学块（optical block）的表面的使用，捕捉分子固定在该表面上。它们在不同的PCR循环之间捕获所扩增的多核苷酸，从而可以检测它们随循环进行的出现情况，并绘制各个目标物的实时曲线。该方法使用在不同温度相继加热的盒体（cartridge）以进行4步骤的过程：变性、退火、延伸和杂交。PCR过程和表面杂交过程的热学要求非常不同。PCR扩增需要的温度循环为，变性步骤在非常高的温度（约95℃）下进行，从而在dsDNA（双链DNA）的熔解温度之上。另一方面，表面杂交需要在低于核酸熔解温度的精确温度下进行，并且为了优化性能，应该避免在扩增子在捕捉探针位点上的扩散有限原位耗尽。该方法已经被提议使用不同的杂交扩增子检测方法：共聚焦扫描（WO06053770）、倏逝场（evanescence field）（WO2008/034896）和禁止角（（forbidden angle））（WO2009/013220）。已建议该方法可以在约3hr或更长时间内检测多个目标扩增子。

需要改进用于多个目标物的实时扩增方法，以获得具有所需的敏感度、再现性和定量性的完全自动、快速（例如，少于1或2小时）且简单的检测。

已经描述过在相对快速的循环时间中的单个或少数目标物PCR。例如，Kopp等人1998（Science280，1046～1048）提议一种具有数次通过变性、退火和延伸用的3个不同温度区的通道的用于流通PCR的芯片。该通道具有用于注射扩增溶液的入口以及用于回收所扩增产物的出口，所扩增产物在之后通过标准方法进行分析，例如凝胶电泳。而且，US6,960,437描述了一种具有旋转的微流体通道和多个沿着该旋转通道存在于不同位置的温度区的微流体装置。微流体通道由弹性体材料制得，当施加力时，该种材料变形，但在移除力时会回复到原始形状。通过循环到通道，溶液经过3个扩增步骤并进行PCR。该专利描述用于获得良好扩增的循环装置的不同部件和特征。使用TaqMan探针（实施例3）或SYBR Green在溶液中或在凝胶电泳之后进行检测。专利提到微阵列的使用，其可以结合到循环通道中从而进行所扩增目标物的检测。然而，没有提到也没有指示怎样在这样的系统中在微阵列上进行检测。

专利申请EP-A-2138587还提议通过将溶液连续通过3个温度区来扩增核酸序列，并在具有固定的捕捉分子的微阵列上进行检测。该方法和装置的特征在于，在指定的杂交区进行杂交和检测，从而可以独立于扩增过程来调节杂交和检测。本发明提供这两个过程的解耦优化。优选的实施方式是单向非循环地流过用于不同循环的通道的不同部件，各个循环具有专用杂交区。专利描述通过不同温度区的通道的不同构造。优选地，在与给定循环对应（对于给定循环和给定杂交时间的杂交扩增子的静态点图）的经过多个杂交区的PCR检定的最后进行单次扫描，以避免在各个循环中快速扫描的需要。在单向流式装置的方法中呈现一个结果。该文件未提及怎样在扩增过程中在微阵列表面上的不同离散区域进行同源杂交。

发明内容