[发明专利]生产和纯化活性可溶唾液酸转移酶的方法

权利要求书

1.生产唾液酸转移酶多肽的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽；收集含有经表达的唾液酸转移酶多肽的细胞培养基；和

b)通过对细胞培养基进行(i)至少一次亲和色谱和/或混合模式色谱步骤和(ii)至少一次阴离子交换色谱和/或阳离子交换色谱步骤，从细胞培养基纯化唾液酸转移酶多肽。

2.根据权利要求1的方法，其中唾液酸转移酶是ST6GalNAcI。

3.根据权利要求2的方法，其中ST6GalNAcI选自以下所组成的组：人、黑猩猩、猩猩、猪、牛、狗、大鼠、小鼠和鸡ST6GalNAcI。

4.根据权利要求3的方法，其中ST6GalNAcI是鸡ST6GalNAcI。

5.根据权利要求4的方法，其中ST6GalNAcI多肽包含根据SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6的氨基酸序列。

6.根据权利要求1至5中任一项的方法，其中唾液酸转移酶多肽只包含唾液酸转移酶活性结构域。

7.根据权利要求1至6中任一项的方法，其中编码EPO信号序列和唾液酸转移酶多肽序列的表达盒被用于在CHO细胞中表达唾液酸转移酶多肽。

8.根据权利要求1至7中任一项的方法，其中通过在达到预定的细胞密度后应用从37℃+/-1℃至32℃+/-1℃的孵育温度改变来实施步骤a)。

9.根据权利要求1至8中任一项的方法，其中步骤b)包括：(i)两次亲和色谱步骤或一次亲和色谱步骤和一次混合模式色谱步骤，(ii)一次阴离子交换色谱步骤和(iii)一次阳离子交换色谱步骤。

10.根据权利要求1至9中任一项的方法，其中按以下顺序实施步骤b)：

i.阴离子交换色谱；

ii.第一次亲和色谱；

iii.第二次亲和色谱或混合模式色谱；

iv.阳离子交换色谱；

11.根据权利要求1至10中任一项的方法，其中使用携带季铵作为功能基团的树脂进行阴离子交换色谱。

12.根据权利要求11的方法，其中使用pH处于7.0和8.0之间的范围的NaCl/Tris-HCl缓冲液作为洗脱剂实施阴离子交换色谱。

13.根据权利要求1至12中任一项的方法，其中使用染料亲和色谱实施第一次亲和色谱。

14.根据权利要求13的方法，其中使用Blue Sepharose Fast Flow树脂实施第一次亲和色谱。

15.根据权利要求14的方法，其中使用pH处于7.0和8.0之间的范围的盐酸L-精氨酸/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施Blue Sepharose亲和色谱。

16.根据权利要求1至15中任一项的方法，其中使用羟磷灰石树脂实施混合模式色谱。

17.根据权利要求16的方法，其中使用pH处于6.3和7.3之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施羟磷灰石亲和色谱。

18.根据权利要求1至17中任一项的方法，其中使用含有磺丙基阳离子交换材料的树脂进行阳离子交换色谱。

19.根据权利要求18的方法，其中使用SP-Sepharose High Performance树脂实施阳离子交换色谱。

20.根据权利要求19的方法，其中使用pH处于6.0和7.0之间的范围的NaCl/磷酸钾缓冲液作为洗脱剂实施阳离子交换色谱。

21.根据权利要求1至20中任一项的方法，其中按以下顺序实施步骤b)：

i.使用Q-Sepharose Fast Flow树脂的阴离子交换色谱；

ii.使用Blue Sepharose Fast Flow树脂的第一次亲和色谱；

iii.使用羟磷灰石树脂的混合模式色谱；

iv.使用SP-Sepharose High Performance树脂的阳离子交换色谱；

22.通过根据权利要求1至21的任一项的方法生产的唾液酸转移酶多肽。