[发明专利]生产布尼亚病毒复制子颗粒的方法

说明书

技术领域

本发明涉及重组病毒领域。更具体地，本发明涉及用于产生不能自主扩散的重组布尼亚病毒颗粒的方法。由此得到的布尼亚病毒颗粒能够用作保护哺乳动物免受布尼亚病毒引起的传染病的疫苗，并且能够用作外源基因的转导的载体。

背景技术

布尼亚病毒科被分为五个属，其中的四个(布尼亚病毒属、内罗毕病毒属、白蛉病毒属和汉坦病毒属)包括能够在人和动物中引起严重疾病的多种病毒种类。熟知的实例为汉滩病毒(HTNV，汉坦病毒属)、克里米亚-刚果出血热病毒(CCHFV、内罗毕病毒属)和裂谷热病毒(RVFV，白蛉病毒属)。

在兽医领域中，RVFV是最可怕的布尼亚病毒之一。反刍动物之间的RVFV的传播是通过受感染的蚊虫的叮咬而发生的，然而，人的感染被认为主要是通过受污染的动物产品释放的悬浮微粒而发生的。成年反刍动物中的死亡率在10至20％变动。未出生和幼年动物中的死亡率可能是更加的令人记忆深刻的接近100％。尽管人的死亡率根据历史事实估算大约为2％，但是在最近的爆发后，报导出了相当高的死亡率。虽然目前，病毒被限制在非洲大陆和阿拉伯半岛，然而传播RVFV的蚊虫并不受限于这些地区。这就解释了对RVFV侵入包括欧洲、亚洲和美洲的世界的其它部分的日益增加的关注。

布尼亚病毒科成员含有包括大(L)片段、中(M)片段和小(S)片段的三片段RNA基因组。所有家族成员从S基因组片段产生结构性核衣壳(N)蛋白，从L基因组片段产生病毒聚合酶蛋白以及从M基因组片段产生G1和G2结构性糖蛋白。通过白蛉病毒和布尼亚病毒的S片段(简称NSs)和M片段(简称NSm)编码非结构蛋白。有趣的是，内罗毕病毒的M片段编码几种结构蛋白和非结构蛋白并且这些病毒的糖蛋白合成和加工与布尼亚病毒科的其他成员完全不同。然而，毫无疑问地，技术人员能够将本发明的技术应用于内罗毕病毒复制子颗粒的生产。

RVFV M片段编码结构性糖蛋白G2(通常简称Gn)和G1(通常简称为Gc)以及至少两个非结构性蛋白(通称为Nsm)。M片段编码带有多个翻译起始位点的单链RNA。翻译产物为Gn，Gc以及至少两个Nsm蛋白。病毒基因组片段包括在3′和5′端上充当用于片段的复制和编码的阅读框的启动子的未翻译区(UTR)。

用于RVFV的反遗传学系统的最近建立为生物学提供了重要的新的见解。在从克隆的cDNA的全RVFV的第一次成功拯救后的几年里，Habjan等人描述了将报告微型基因组包封到类病毒颗粒(VLP)(Habjan等人.2009.Virology385，400-408)。在报告微型基因组的存在下，通过NSm、Gn、Gc、N和L蛋白的瞬间表达来生产VLP。N和L蛋白诱导来自复制的微型基因组的报告蛋白的表达和随后将结构性糖蛋白将微型基因组包封到VLP。这些VLP显示将报告微型基因组转运至接收的细胞。然而，在这些细胞中，观察到初级转录，微型基因组的复制依赖于来自转染的质粒的N和L蛋白的产生。仅仅感染有VLP且并不共转染表达N和L蛋白的构建的细胞表现出对病毒蛋白的限制表达。病毒基因组是不能复制的，并且在这些细胞中不存在基因组的扩增。因此，在这些细胞中仅仅发生病毒基因组的初级转录。

尽管RVFV、HTNV和CCHFV在人中引起高病死率的严重疾病，没有疫苗能够有效地在人类中预防这些疾病，并且没有注册过的抗病毒药物用于暴露后处理。这些控制手段的发展的重度复杂的事实是：必须在高生物安全防护措施下处理这些病毒。RVFV还在牲畜中引起高病死率的严重疾病。在非洲大陆以外使用已经注册的有效的但并不安全的疫苗。

因此，迫切需要开发用于布尼亚病毒颗粒的安全且有效生产的手段和方法。

发明内容

本发明公开非传播的布尼亚病毒复制子颗粒，该布尼亚病毒复制子颗粒能够自主基因组复制。在NSm编码区的存在和缺失的情况下，通过在结构性糖蛋白G1(RVFV的G1称为Gc)和G2(RVFV的G2称为Gn)的反式互补作用均能生产布尼亚病毒复制子颗粒(BRP)。生产的BRP高达10E7有感染力的颗粒/ml的滴度。所得到的颗粒能够在生物安全防护设施外，在体内或体外用于研究病毒的生命周期的各个方面。此外，上述颗粒能够用在病毒中和试验中，该病毒中和试验能够在生物安全防护设施外进行，并且生产的抗原可被用于ELISA以及其它血清学试验。此外，本文所述的方法将有利于治疗学和疫苗的发展，所述疫苗使失活的疫苗的安全性以及减毒活疫苗的有效性最佳组合。所述方法也可用于新型基因导入系统的建立。