[发明专利]用于扩增核酸的方法

权利要求书

1.用于扩增靶标核酸的方法，所述方法包括如下步骤:

a)提供具有多个核酸捕获探针的支持物,其中所述多个探针通过核酸的5'末端固定在支持物上,

b)将靶标核酸与捕获核酸探针杂交以形成探针/靶标复合物,

c)用聚合酶延伸捕获探针核酸，其中靶标核酸被用作捕获探针核酸延伸的模板,

d)将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸，其中将发夹核酸的5'末端连接至经延伸的探针的3'末端并且将发夹核酸的3'末端连接至靶标核酸的5'末端,

e)使靶标核酸的3'末端结合至所述支持物上的所述多个核酸捕获探针中的另外的探针,

f)通过聚合酶延伸所述另外的探针的3'末端,

g)通过重复步骤e)和f)扩增步骤f)中所获得的核酸。

2.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3'至5'的校正外切核酸酶活性并且其中所述发夹核酸形成平端茎。

3.权利要求1或2的方法，其中步骤c)的聚合酶是Pfu(激烈火球菌(Pyrococcus furiosus))DNA聚合酶。

4.权利要求1的方法，其中步骤c)的聚合酶具有3'末端转移酶活性，导致在双链核酸的3'末端的突出端，并且其中所述发夹核酸具有5'突出端，与双链核酸的3'互补。

5.权利要求1或3的方法，其中步骤c)的聚合酶是Taq(水生栖热菌)DNA聚合酶，生成腺嘌呤的3'突出端，并且其中发夹的5'突出端是胸腺嘧啶核苷。

6.权利要求1的方法，其中步骤c)中的聚合酶是Klenow聚合酶，其在存在单一类型的核苷酸时使用，沿着捕获的片段序列生成一系列相同的核苷酸。

7.权利要求6的方法，其中所述单一类型的核苷酸是dTTP。

8.权利要求1的方法，其中步骤d)的将经延伸的靶标/探针双链核酸连接至发夹核酸是在连接反应中存在PEG8000时进行的。

9.权利要求1至8任一项的方法，其中所述靶标核酸是DNA。

10.权利要求1至9任一项的方法，其中发夹序列在其环中包含用于罕见的限制性内切核酸酶的序列。

11.权利要求1至10任一项的方法，其中支持物是平面支持物，包含不同的区别区域，每个区域包含多个不同的探针。

12.权利要求1至10任一项的方法，其中支持物是微载体，其中所述微载体包含多个一种核酸捕获探针。

13.权利要求12的方法，其中所述微载体包含可检测标记并且其中该可检测标记限定了附着至微载体的捕获探针的序列。

14.权利要求1至13任一项的方法，其中在权利要求1的步骤g)中的扩增之后进行相应于靶标核酸的核酸序列确定。

15.权利要求14的方法，其中所述序列确定是在平面支持物上或者在权利要求13的标记的微载体上进行的，还包括将确定的序列与平面支持物上的区域或微载体上的标记相关联的步骤。