[发明专利]引物珠粒

说明书

技术领域

本发明涉及核酸化学和分子生物学领域，并且更具体地讲，涉及有助于引物的纯化、标准化和储存以及其向扩增反应的递送和释放的试剂和方法。

背景技术

目前，酶促扩增反应，例如聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）被广泛使用。这一普遍性促使酶反应组装的简化，以便提高反应产物的产率和质量并且降低成本。

PCR中使用的试剂已经被冷冻干燥（U.S.5,834,254）或囊封，由此使扩增反应设置简单地为添加水、目标DNA模板和引物。举例来说，来自GE医疗集团（GE Healthcare）的“即用型RT-PCR珠粒（Ready-To-Go RT-PCR Bead）”含有除模板RNA和引物以外扩增反应所需的所有组分。

已经提出多种引物递送方式来使液体处理和交叉污染减到最少。固定在涂有抗生蛋白链菌素的表面上的标记生物素的引物（威斯汀（Westin）等人）或共价地固定于固体支撑物的引物（U.S.7,582,470）被描述用以扩增互补目标序列。美国专利7,615,193描述了用机器人将珠粒递送到PCR孔中，但未披露珠粒的类型、珠粒表面的组成以及用于制备引物结合珠粒的方法。

扩增反应混合物的组装温度通常低于产生引物杂交特异性并且引起与目标序列的扩增相竞争的引物延伸所需的温度(Chou等人,1992)。这会显著降低目标序列的扩增效率，尤其是当扩增含有较低模板拷贝数的样品时更是如此，并且这是PCR的主要缺点。在“热启动（hot-start）”扩增中，反应混合物中的一种或一种以上试剂被截留，或者以化学方式或酶促方式阻断，直到达到提供必要杂交特异性的温度。此举将在低引物杂交特异性的时间期间抑制引物延伸，并使引物二聚体的形成最少。为了将扩增限制于已知引物主要与预定目标序列杂交的温度，可以将试剂截留并在初始的高温保温步骤之后添加到反应孔中。这种最早的热启动方法尽管有效，但相当麻烦并且很快就被用例如蜡等热敏材料进行的反应组分物理分离所代替。当在变性步骤期间热敏材料熔融后，使启动扩增反应所需的所有试剂混合（U.S.5,411,876）。其它热启动方法依赖于镁的隔离作用（WO2003012066）、酶的热活化（U.S.5,773,258和U.S.5,677,152）或聚合酶特异性抗体对聚合酶的可逆抑制作用。当通过升高温度来使抗体失活时，扩增反应开始（U.S.5,338,671）。为了阻止引物延伸，已经通过形成发夹环（U.S.5,866,336）或通过用热不稳定性保护基保护3'-羟基（U.S.6,509,157；勒贝迪夫（Lebedev）等人,2008）来阻断引物。由于在达到确保引物杂交特异性的温度之前，这些引物无法支持引物延伸，故非特异性扩增减少。当前的热启动方法的缺点源自其对昂贵引物、特异性聚合酶或抗体，或者对有限的通量的依赖性。

需要获得一种可靠、简单并且经济的非手动的“热启动”PCR。

发明内容

以上和其它目的是通过使用珠粒将寡核苷酸引入反应中的方法实现。所述珠粒在珠粒表面上具有标准化、非共价结合的寡核苷酸。随后，在例如PCR等酶促反应期间，所述珠粒将这些寡核苷酸从珠粒逐渐释放。额外的初始步骤可以包括通过将标准化量的纯化的寡核苷酸捕获在珠粒上来纯化（例如脱盐）粗寡核苷酸溶液，从而制备所述珠粒。在此方法中，所述寡核苷酸可以为皮摩尔量的引物。

在一些实施例中，所述珠粒是具有非极性疏水性表面的多孔或无孔玻璃珠。这些珠粒可以具有非极性疏水性表面，所述表面包括选自C₃到C₂₀的线性或分支烷基链、芳基、苯甲基、萘基、菲基和三苯甲基。制备珠粒的初始步骤可以包括使玻璃珠与硅烷反应。在一些实施例中，珠粒包括非极性疏水性表面，所述疏水性表面包括表面(芳基)_n-X-烷基，其中所述芳基选自由苯基、苯甲基、联苯基、萘基、三苯甲基组成的群组；X=C、O、S、SC(O)N、OC(O)N、NC(O)和N；n=1到3，n是等于或大于1的有限整数。

在一些实施例中，通过结合含有至少一种污染物的粗溶液中具有5'-疏水性部分的寡核苷酸，来纯化寡核苷酸。