[发明专利]通过在获自细胞培养物的液体中改变PH灭活蛋白酶的方法

说明书

发明背景

技术领域

本发明属于制造生物制药产品的领域。其具体涉及通过在不含细胞的细胞培养物上清液中灭活蛋白水解活性酶来改进制备生物制药产品的方法。

背景

生物分子(例如蛋白、多核苷酸、多糖等)不断获得商业重要性，以用作药物、诊断试剂、食品添加剂、洗涤剂等，用作研究试剂和用于许多其他应用。对所述生物分子(例如蛋白)的需求一般不再通过从天然来源分离分子而得以满足，而是需要使用生物技术生产方法。

经生物技术制备蛋白通常由克隆DNA片段至合适的表达载体中开始。转染所述表达载体至合适的原核或真核表达细胞及随后选择受感染的细胞后，将受感染的细胞在发酵罐中培养，并表达所需蛋白。然后采集细胞或培养物上清液，并将其中所含的蛋白进行后处理和纯化。

众所周知，蛋白酶存在于采集的液体中，例如在不含细胞的培养物上清液中。生物药物(例如单克隆抗体或重组蛋白)以及色谱材料(例如固定的蛋白A)均被蛋白酶迅速降解或破坏结构。这导致损害产物品质(同质性、功能性)，而且在色谱材料中降低结合容量，导致污染结合的产物级分。尤其在不含血清的培养和高产量细胞中，制备的生物药物以高相对浓度存在，因此尤其易于被蛋白水解性损坏其分子结构，导致同时产率降低和产物品质降低。

蛋白酶导致的蛋白损坏甚至可以在中性pH发生，但是尤其当不含细胞的培养物上清液必须调节至酸性pH水平以用于纯化方法时(例如，为了为捕获步骤(例如阳离子交换色谱(预处理))创造所需的结合条件)，可以观察到广泛的蛋白降解。

众所周知，通过改变pH水平不可逆地灭活了一些蛋白酶(例如消化酶，例如胃蛋白酶)(Z.Bohak,Purification and Characterization of Chicken Pepsinogen and Chicken Pepsin,Journal of Biological Chemistry244(17)(1969)4633–4648;B.Turk,V.Turk,Lysosomes as Suicide Bags in Cell Death:Myth or Reality?,Journal of Biological Chemistry284(33)(2009)21783–21787)。已经提议加入蛋白酶抑制剂(A.J.Barrett,A.A.Kembhavi,M.A.Brown,H.Kirschke,C.G.Knight,M.Tamai and K.Hanada,L-trans-Epoxysuccinyl-leucylamido(4-guanidino)butane(E-64)and its analogues as inhibitors of cysteine proteinases including cathepsins B,H and L,Biochem.J.201(1982)189–198)。然而，这些蛋白酶抑制剂非常昂贵、具有毒性且难以从产物中去除。因此，蛋白酶抑制剂不是经济地生产安全药物的选择。

发明概述

本发明涉及通过在纯化生物药物的方法开始时，重复地改变细胞培养物上清液的pH而灭活蛋白酶的方法。本发明的优点在于提高产物品质和产物产率，以及延长色谱材料的寿命。

令人惊奇地，已经发现采集的哺乳动物细胞系(例如CHO，中国仓鼠卵巢细胞)的不含细胞的发酵上清液中含有以下蛋白酶：其可以通过改变至酸性pH而活化，也可以在最适pH通过随后改变pH至中性范围而不可逆地灭活其活性。在中性pH水平具有活性的蛋白酶也可以在中性条件下通过改变至酸性pH水平而不可逆地灭活其活性。

本发明具体涉及在获自细胞培养物的液体中灭活蛋白酶的方法，包括以下步骤：

(a)调节所述液体的pH至3-5，然后

(b)调节所述液体的pH至7-9。

附图说明

图1：通过两次改变pH活化和灭活来自CCF的蛋白酶。

图2：在酸性pH降解模型底物干扰素(IFN)。将0.1mg/ml干扰素在37°C与10%(v/v)细胞培养物上清液(CCF)一起在pH4培养0或14小时，伴随和不伴随pH改变(泳道2至4)，并通过SDS-PAGE分离。在20°C进行pH改变，且在pH4和pH7暂停5分钟。与没有pH灭活相比，通过改变pH(泳道3)使得IFN的降解显著减少。14小时后，IFN已经完全分解(泳道4)。

泳道的布置：

1–标记

2–IFN(0.1mg/mL)，培养前