[发明专利]利用回文序列生产闭合线性DNA

说明书

技术领域

本发明涉及一种回文引物，其用于扩增包含原核端粒酶(protelomerase)靶序列的脱氧核糖核酸(DNA)模板。

背景技术

用于大批量扩增DNA的传统的基于细胞的过程是昂贵的。例如，细菌的使用需要它们大量地生长在昂贵的发酵罐中，其中上述发酵罐需要保持在无菌状态下以防止培养物的污染。还需要溶解细菌以释放扩增DNA并且DNA需要被清洗和纯化自其它细菌成分。尤其是，在产生DNA疫苗或其它治疗性DNA剂的情况下，需要高纯度以消除对哺乳动物具有毒性的内毒素的存在。

除成本问题以外，在许多情况下，细菌的使用可以面临扩增过程的保真度的困难。在细菌细胞的复杂的生化环境中，难以控制所期望的DNA产物的质量和产量。细菌可以偶尔改变在扩增DNA内所需要的克隆的基因并且使它对于所需的目的是无用的。在感兴趣的DNA的忠实的生产中重组事件还可以产生问题。用于扩增DNA的无细胞酶促过程可以避免要求使用宿主细胞，因此是有利的。

例如，药用DNA盒(cassette)的制造几乎完全依赖于它们插入细菌质粒以及它们在细菌发酵过程中的扩增。

本领域方法的目前状态以多种方式限制了用于改善上述DNA药物的制造的机会。另外，质粒产物基本上是粗制DNA分子，因为它包含其药用功能不需要的核苷酸序列。因此，在DNA产物(如DNA药物)的生产领域中，需要提供用于大批量扩增DNA的改善的方法。尤其是，需要提供用于扩增DNA的特定形式(如闭合线性DNA)的改善的方法。闭合线性DNA分子可以特别用于治疗性应用，因为相比于DNA的其它形式它们具有改善的稳定性和安全性。

发明内容

本发明涉及使用至少单种引物来扩增DNA模板。上述引物可以用于生产线性共价闭合DNA(闭合线性DNA)。模板DNA包含至少一种原核端粒酶靶序列。本发明的引物特异性地结合于在至少一个原核端粒酶靶序列内的回文序列并且能够引发在两个方向上的扩增。因此仅需要单种引物来引发每个模板。另外，和其它形式的引物相比，就扩增DNA产物的均匀性而言，可以获得好处。

因此，本发明提供了：

一种引物，其能够特异性地结合于在原核端粒酶靶序列内的回文序列并引发在两个方向上的扩增。

用于生产闭合线性脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法包括：

(a)在有至少一种引物存在的条件下并在促进所述模板的扩增的条件下，使包含至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板接触至少一种DNA聚合酶，其中至少一种引物能够特异性地结合于在至少一种原核端粒酶靶序列内的回文序列并且能够引发在两个方向上的扩增；以及

(b)在促进闭合线性DNA的生产的条件下，使在(a)中产生的扩增DNA接触至少一种原核端粒酶。

用于扩增脱氧核糖核酸(DNA)的体外无细胞方法包括：

在有至少一种引物存在的条件下并在促进所述模板的扩增的条件下，使包含至少一种原核端粒酶靶序列的DNA模板接触至少一种DNA聚合酶，其中所述模板的扩增是借助于复制链的替换(displacement)并通过另一条链的链替换复制(strand displacement replication)，其中至少一种引物能够特异性地结合于在至少一种原核端粒酶靶序列内的回文序列并且能够引发在两个方向上的扩增。

本发明进一步涉及试剂盒，其提供了在本发明的方法中必要的成分。因此，本发明提供了一种试剂盒，其包括至少一种按照本发明的引物和至少一种DNA聚合酶。试剂盒可以进一步包括至少一种原核端粒酶以及可选地用于扩增本发明的闭合线性DNA的方法的说明书。

附图说明

图1：在噬菌体中线性共价闭合DNA的复制和原核端粒酶的作用。A.染色体外噬菌体线性共价闭合DNA的描述。*＝端粒的回文序列的中心。R序列是L序列的反转回文重复。B.在宿主中噬菌体DNA的复制：气泡(bubble)表示DNA链复制。相对于R和L的互补链的合成导致相同的双链RL序列。C.通过原核端粒酶的作用所形成的产物。原核端粒酶结合于RL序列并切割和连接在回文序列的中心点处的相反链以改造端粒并完成原始线性共价闭合DNA的复制。