[发明专利]用于分离结合至任何类型的目的核酸序列的蛋白质的方法

说明书

真核生物DNA在染色体的情况下被许多蛋白质复合物结合和解释(interpreted)。

调控特定基因座的全套蛋白质的描述对于理解基因表达和调控是至关重要的。

细胞代谢，例如基因组维持、基因表达、程序化细胞增殖等借助于受密切调控的蛋白质(所述蛋白质携带翻译后修饰并且作为蛋白质网络的一部分)的特定组合在染色质中进行归档(索引)。

尽管进行了大量的表征努力，但染色体仍然是未得到充分表征的细胞器官(Kornberg和Lorch,2007).

理解籍以将转录历史编码和存储在染色质中的方式是个巨大的挑战，其目前因缺乏方便的分离染色质的特定片段(在下文中称为目的染色质(CoI))和分析它们的蛋白质含量(作为生长状况、细胞周期、细胞类型等的函数)的方法而受到限制。

术语“目的染色质”片段是指，特定核酸序列(即给定的基因)与所有结合的蛋白质之间的复合物。

鉴于基因组例如人基因组(3x10⁹bp)的巨大尺寸，此类特定核蛋白片段的分离是个特别费劲的任务。

为了分离与单个人基因(3kb的理论平均尺寸)相关的染色质片段，人们将需要从10⁶个片段中分离出1个片段。

存在对简化CoI片段的分离的方法的需要。

在过去的25年中，已寻求各种染色质分离策略来建立基因座特异性蛋白质组成。

虽然每一个策略都实现了靶区域的富集，但没有一个策略以足以允许鉴定结合的因子的量和纯度提供材料。

Déjardin和Kingston(Cell 136,175-186,2009年1月9日)描述了基于Watson-Crick杂交的分离含端粒染色质片段的方法。

但该技术仅可用于这样的端粒片段，其包含能够通过Watson-Crick碱基配对与互补寡核苷酸探针杂交的单链区域(3'-悬突)。

端粒是个例外，因为(1)它们天然包含具有已知序列(从而可与互补探针形成Watson-Crick碱基对)的单链DNA，(2)它们是过表达的(over-represented)，因为每个细胞存在92个端粒。

因此，所描述的技术不是通用的，并且不允许分离在染色体末端以外(即染色体中的任何地方)的核蛋白片段(其更有利地不依赖于目的片段的核酸序列)。

存在对这样的方法的需要，其允许分离位于染色体(有利地染色质片段)中的任何地方的目的核蛋白片段，且更有利地不依赖于目的片段的核酸序列。

本发明的目的之一是提出这样的方法。

本发明提供了用于分离和鉴定结合于任何类型的目标核酸序列(目的序列：SoI)，有利地结合于任何类型的目标DNA序列(特别是在活细胞或试管中的染色体DNA或RNA或附加型DNA的情况下)的蛋白质的新型方法。

在本发明的背景下，活细胞包括含有核酸材料(需要分析其所结合的蛋白质)的任何生物，例如病毒、细菌、细胞。

本发明基于位于SoI附近的特定核酸序列标签，有利地能够形成三股螺旋的特定双链DNA(称为形成三螺旋的标签序列(TFT序列))的使用。

本发明适用于上文中定义的任何类型的活细胞中的任何来源的核酸(SoI)，因为可将预定长度的短的形成三螺旋的标签(TFT)引入所述目的序列(SoI)和与其结合的蛋白的附近。

有利地，本发明适用于任何来源的DNA(染色体、附加型、病毒等)。

根据本发明，TFT序列可以在细胞中作为附加型DNA的部分或整合在研究的目标核酸序列附近。

根据本发明，TFT序列可与称为形成三螺旋的寡核苷酸(TFO)的特定寡核苷酸探针形成以三股螺旋的形式存在的稳定复合物。

无论TFT序列的最终形式是什么(附加型或整合的)，其可以为单一序列(a single sequence)或重复序列的形式。当其为重复序列的形式时，重复序列可连续地或间隔地头对头或头对尾地排列。

因此根据本发明，所述方法的第一步骤是，在其复合的蛋白质有待分析的SoI附近引入TFT序列。

当将TFT引入SoI的附近时，可通过使用TFO探针从无关核酸片段的复杂混合物中纯化SoI及其结合的蛋白质。

因此，本发明的第一目的涉及，用于分离结合至任何类型的目标核酸序列(目的序列：SoI)的蛋白质的新方法，其中

-在第一步骤中，将形成三螺旋的标签(TFT)引入活细胞的所述核酸序列中，并培养所述活细胞；