[发明专利]直接检测和鉴别稀释于富集肉汤中的生物样品中的微生物的方法

说明书

本发明大体上涉及分析领域，例如生物分析领域。更具体地，本发明涉及在密闭容器内直接且实时地检测稀释或者悬浮于富集肉汤的样品中的微生物的方法。

微生物分析需要获得结果所花费的时间必须尽可能短的精确技术。

在医学领域，预见和诊断感染风险是必要的：诊断越快越精确，则对患者的处理会越有效率，并且传播的风险会更小。对于动物健康，方法也是类似的。

在农产品领域，问题是相同的。但是，其重点在于以下几方面：

·存在于原材料、中间产物和上市成品中的病原微生物及其毒素，

·在从原料到成品的生产过程中沿整条生产链用作质量指标的非病原微生物，以及

·有技术意义的细菌，例如酶。

对可疑污染物的快速精确的检测使得能够对其进行监控，从而能够采取正确的措施。

从技术层面讲，微生物分析可能进行一个或者多个预富集和/或富集阶段、一个或者多个检测阶段以及一个或者多个微生物计数阶段。对于具体应用例如农产品微生物监控而言，可能还需要确认阶段，以满足该领域执行的标准。

目前，还没有不使用富集步骤而在大量初始样品中检测目标微生物的方法。

预富集和/或富集阶段使用选择性或者非选择性培养基，目的是促进生物样品或者环境样品中的目标微生物的生长，同时限制非目标菌群的生长。培养基通常用于无菌塑料袋型容器中，它们在其中与食品样品或者环境样品接触，以重悬浮和重富集寻找到的微生物。这一阶段是必需的，目的是满足下述要求：揭示非常多变且可能非常大量的样品(例如稀释于225-3375毫升(mL)培养基中的25克(g)至375g样品)中的至少一种目标微生物的可能的初始存在。该富集步骤结束时，取一份(5微升(μl)至5mL)样品进行检测目标微生物的步骤。在这份样品中必须具有足量的目标微生物，以实现对其的系统检测。

过去，检测阶段的基础是在琼脂培养基上培养微生物，以证明所研究微生物的代谢特征。通常使用特定的酶底物。这些酶底物一般包含两个部分：对待揭示的酶活性具有特异性的第一部分(也称为目标部分)和作为标记物的第二部分(也称为标记物部分)，所述第二部分通常由生色团或者荧光团构成。通过根据是否有反应选择这些底物，可表征微生物的性质或者区分开不同组的微生物。因此，颜色或者荧光的出现或者消失会指示微生物的属或者类型。在这一点上，生色培养基的使用使得能够同时检测和鉴别所研究的病菌。它简化了方法，并且大幅地减少了获得结果所花费的时间。例如，我们举例申请人的培养基。这些生色培养基的基础是检测所研究细菌的特定代谢特征，例如对大肠杆菌(Escherichia coli)的β-葡糖醛酸糖苷酶的酶活性。

免疫测定构成用于检测试验的另一种技术。它们利用所研究微生物的免疫原性特征。非穷举地，可以举例竞争性或夹心型ELISA(酶联免疫吸附测定)。

最后，还采用基于所研究微生物的基因组特征的分子生物学技术来检测和鉴别目标微生物。例如，可以举例常规的扩增技术，例如PCR(聚合酶链反应)和NASBA(基于核酸序列的扩增)，其可以与本领域技术人员已知的实时检测技术联用。

但是，所有这些技术的使用均需要在预富集/富集阶段结束时打开袋子，以回收一份匀浆并进行检测步骤。

在农产品领域，确认阶段自身与微生物分析更加特别相关。事实上，在上述方法的结果是阳性时，必须确认所研究病原体的存在。这使得互补试验和使用不同于在首次分析过程中使用的检测原理成为必需。随意使用上述技术以进行确认。

因此，完全地和精确地鉴别样品中的微生物必需一系列的几个步骤：富集、检测和确认。常规使用的测试的标准化已使检测方法的自动化称为可能，但是其实施仍需很长时间。事实上，现有技术的缺点是，这些步骤是连续进行的，且需要大量耗时的操作，因此影响到得到结果所需的时间。

再者，上述技术需要将富集袋打开一次或者多次以采集多份样品。在筛选(尤其是在农产品产业中)期间的阴性样品数越多，则越不利。因此，考虑对操作者有益的是无需再次打开容器来查明研究样品的阳性/阴性结果。

针对以上考虑到的与现有技术状况相关的技术问题，本发明的一个基本目的是提供一种简单的检测、鉴别和确认存在于样品特别是农产品样品中的微生物的方法。

本发明的另一个目的是提供一种检测、鉴别和确认微生物的方法，该方法限制了对容器中所含的样品的处理，由此限制了对处理样品的工作人员和样品自身两方面的污染风险。

本发明的另一个目的是提供一种检测和鉴别微生物的方法，该方法减少了分析样品所必需的时间。