[发明专利]纳米孔阵列用于核酸多重测序的用途

说明书

相关申请的交叉引用

本申请要求2010年5月11日提交的美国临时申请号61/395,323的权益或优先权，所述临时申请的整个公开内容全部以引用方式并入本文。

政府支助

本发明在美国国家卫生研究院(National Institutes of Health)授予的合同号HG-004128下通过政府的支助来产生。政府对本发明享有某些权利。

发明领域

本发明涉及核酸分析领域。具体地说，本发明涉及对来自纳米孔阵列的单一分子信号进行光学成像以便分析核酸序列。

背景

基于纳米孔的DNA测序被广泛地认为是有希望的下一代测序平台(参考文献[1,2])。纳米孔方法的两个主要特征使其特别适用于基于单一分子的基因组分析：首先，该方法能够以电泳方法集中来自大量分子中的极长DNA分子并使其穿过纳米孔，从而使得分析微小的DNA样本成为可能(参考文献[3])；其次，亚5nm纳米孔现在被常规用于线性化较长的DNA线圈，因而在原则上，纳米孔可用于有效地‘扫描’较长基因组上的信息。这些特征以及可在高密集阵列中制造固态纳米孔的事实(参考文献[4,5])，允许开发大规模并行检测，并且对于实现无扩增、低成本以及高通量测序是关键的(参考文献[2,6-9])。

纳米孔是将两个含有离子溶液的腔室分隔开的超薄膜中的纳米大小的孔。跨膜施加的外部电场会产生离子流和孔附近的局部电势梯度，从而吸引生物聚合物并且使其以一列纵队(singlefile)方式穿过孔(参考文献[3,10])。当生物聚合物进入孔中时，其使一部分电解质移位，从而引起孔电导率的变化，这种变化可直接使用静电计来测量。最近已经提出许多基于纳米孔的DNA测序方法，并且这些方法强调两个主要难题(如参考文献[1,11]中所描述)：(1)在单独核苷酸之间进行区别的能力，即系统必须能够在单一分子水平上区分四种碱基；和(2)该方法必须能够并行地读出。因为单一纳米孔每次只可探测单一分子，所以需要制造纳米孔阵列并且同时对其进行监测的策略。

迄今为止，尚未证实通过任何基于纳米孔的方法所进行的并行读出。很多当前这代(和将来一代)的测序方法都依赖于在读出过程中使用酶(聚合酶、外切核酸酶等)。然而，酶活性的动力学是提高读出速度的主要瓶颈，并且这些方法受酶的未受扰乱的活性所支配。

发明概述

本发明部分地基于如下发现：在读出级期间，不需要酶的情况下，用于高通量碱基识别的基于纳米孔的方法是可行；并且部分地基于能够对来自多个纳米孔的信号进行光学检测的方法的开发。

应理解，除非以下描述的任何实施方案是相互排斥的，否则它们可以任何所需方式组合。还应理解，任何实施方案或实施方案的组合可应用于以下描述的每个方面。

一方面，本发明提供用于分析核酸的方法，所述方法包括：(a)在载体分子穿过纳米孔阵列中的多个纳米孔发生受控易位期间，将多个光学标记的寡核苷酸从多个载体分子上移位，其中每个载体分子通过纳米孔阵列中的不同纳米孔；以及(b)当所述光学标记的寡核苷酸从不同载体分子上移位时，检测来自所述光学标记的寡核苷酸的多个光学信号。

在一些实施方案中，纳米孔阵列中的纳米孔处于厚度为约0.1nm至约1μm的固态膜中。

在一些实施方案中，固态膜包含产生机械稳定膜的材料。在一些实施方案中，膜包括硅、氮化硅、氧化硅、氧化钛、氧化铝或石墨烯。

在一些实施方案中，纳米孔具有约1nm至约20nm的直径。在一些实施方案中，纳米孔间隔开约0.5至约10μm。在一些实施方案中，纳米孔阵列包括2个至约100,000个纳米孔。

在一些实施方案中，所述方法进一步包括用光源激发与光学标记的寡核苷酸相关的光学标记。在一些实施方案中，光源是激光。

在一些实施方案中，光学标记是用多个光源来激发，其中每个光源具有不同的发光光谱。在一些实施方案中，检测来自膜表面的光学信号。

在一些实施方案中，光学信号是用能够以至少500帧/秒进行记录的装置来检测。在一些实施方案中，光学信号是用能够以至少1,000帧/秒进行记录的装置来检测。

在一些实施方案中，光学检测包括对分裂至获取传感器的不同区域上的多个光谱进行并行检测。在一些实施方案中，区域数量是2个。在其它实施方案中，区域数量是4个。

在一些实施方案中，获取传感器上的每个区域在每个获取帧产生单独的图像。在一些实施方案中，每个图像代表目标核酸序列中的单一核碱基。