[发明专利]自删除质粒

权利要求书

1.制备无选择标记基因的质粒的方法，所述方法包括以下步骤：

a)在第一宿主细胞环境中培养含有选择标记基因的质粒，所述选择标记基因的侧翼为位点特异性重组酶靶位点，所述第一宿主细胞环境不能实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组；以及

b)随后在第二宿主细胞环境中培养所述质粒，所述第二宿主细胞环境能够实现所述位点特异性重组酶靶位点之间的重组，从而去除所述选择标记基因。

2.如权利要求1所述的方法，还包括以下步骤：

c)在细胞培养中维持所述无选择标记基因的质粒。

3.如权利要求1或2所述的方法，还包括以下步骤：

d)从所述第二宿主细胞环境分离所述无选择标记基因的质粒。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点与实现位点特异性重组所必需的附属序列在功能上相关联。

5.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在不同的细胞内。

6.如权利要求5所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境在编码PepA、ArgR和ArcA的基因中的一个或多个中包含失活突变。

7.如权利要求5或6所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含ArgR或ArcA基因和PepA基因的活性形式。

8.如权利要求5所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含位点特异性重组酶。

9.如权利要求7所述的方法，其中所述位点特异性重组酶是内源性位点特异性重组酶。

10.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境在相同的宿主细胞中形成。

11.如权利要求9所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境是暂时分开的。

12.如权利要求9或10所述的方法，其中所述第二宿主细胞环境包含诱导型位点特异性重组酶。

13.如权利要求9-12中任一项所述的方法，其中通过改变所述细胞的温度，改变所述细胞的渗透浓度，改变所述细胞中诱导剂的水平或改变所述细胞中能改变所述质粒的二级结构或超螺旋的化合物的水平来形成所述第二宿主细胞环境。

14.如权利要求8、9、12或13中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶选自Cre、Flp、R、XerC、XerD、RipX和CodV。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点是转座酶靶位点。

16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述位点特异性重组酶靶位点选自Ecdif、cer、psi、pif、mwr、Bsdif、loxP、FRT和RS。

17.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因是抗生素抗性基因。

18.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述选择标记基因能允许产生在所述第一和/或第二宿主细胞环境中缺少，但又是所述第一和/或第二宿主细胞环境必需的代谢物。

19.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是革兰氏阴性细菌细胞。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和所述第二宿主细胞环境独立地选自埃希氏菌属(Escherichia)、沙门氏菌属(Salmonella)、志贺氏菌属(Shigella)、农杆菌属(Agrobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)和弧菌属(Vibrio)。

21.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述第一宿主细胞环境和/或所述第二宿主细胞环境是革兰氏阳性细菌细胞。