[发明专利]组蛋白瓜氨酸肽及其应用

说明书

发明领域

本发明涉及衍生自组蛋白H4蛋白的瓜氨酸合成肽，和其在诊断自体免疫疾病特别是类风湿性关节炎（RA）中的应用。

当前技术水平

类风湿性关节炎（RA）是以T和B细胞介导的自体免疫机制为特征的炎性关节病。在RA患者的生物液体中能检测到不同的自体抗体。一些这种自体抗体能用于RA诊断和跟踪。

最著名的RA生物标记是类风湿因子（RF），这是针对免疫球蛋白IgG同种型Fc区的IgG或IgM类抗体。然而，由于其也能在其他病理条件和老年健康个体中发现，RF不是特异性的RA标记。使用抗核周因子和抗角蛋白抗体发现RA中涉及瓜氨酸(cit)表位推进了新型高特异性RA生物标记的鉴定。不同的瓜氨酸肽和蛋白用于设定特异和灵敏的诊断试验，能识别RA自体抗体，因此通常称为抗瓜氨酸肽(CP)抗体(ACPA)[US20020143143,US20070087380,EP1946109,US20070148704,WO2009007846,WO2009000077,WO2007017556,EP1456662,WO1999028344,WO2008132264]。与RA相关的所有蛋白中，下列瓜氨酸序列用于诊断试验:纤维蛋白[C.Masson-Bessière等，J.Immunol.2001,166,4177]，胶原II[H.Burkhardt等，Eur.J.Immunol.2005,35,1643]，波形蛋白[E.R.Vossenaar等，Arthritis Rheum.2004,50,3485]，丝聚蛋白[US20090028885,US7445903,US6890720]，和病毒蛋白[C.Anzilotti等，J.Rheumatol.2006,33,647;WO2004087747]。

测试的灵敏度通过使用丝聚蛋白衍生的合成环瓜氨酸肽(CCP)来增加，[G.A.Schellekens等，J.Clin.Invest.1998,101,273][WO1998022503]，所述环瓜氨酸肽特征为使瓜氨酸最佳暴露以用于抗体结合的结构。目前，发展出三代CCP测试：CCP1(灵敏度68%,特异性98%)[G.A.Schellekens等，Arthritis Rheum.2000,43,155]，CCP2(灵敏度范围39-94%,特异性范围81-100%)[J.Avouac等，Ann.Rheum.Dis.2006,65,845]，和CCP3(灵敏度范围51-83%,特异性范围93-98%)[L.Lutteri等，Clin.Chim.Acta2007,386,76]。这些RA诊断ELISA都市售可得（荷兰阿纳姆的ED公司（Euro-Diagnostica）；苏格兰敦提的轴盾公司（Axis-Shield）；美国圣地亚哥的INOVA公司）。

近来，使用爱泼斯坦-巴尔病毒的EBNA-1(VCP1)和EBNA-2(VCP2)衍生的瓜氨酸序列能设定特征为特异性和灵敏度与CCP2和CCP3测试报道的那些相似的诊断试验[F.Pratesi等，Arthritis Rheum.2006,54,733;C.Anzilotti等，J.Rheumatol.2006,33,647;WO2004087747;EP091767764]。有趣的是，基于CCP2、CCP3、VCP1和VCP2的测试性能比较表明不同的瓜氨酸序列能检测相同患者组中抗CP抗体的不同亚组。这些结果证明与XG或XnonG单位(X=瓜氨酸)的假设独有作用相比，瓜氨酸残基周围的氨基酸序列在形成抗CP表位中起重要作用[EP1693673]。

通过组蛋白表示与其他自体免疫疾病相关但尚未直接涉及RA诊断的另一类蛋白。组蛋白是核小体的成分，并且分成六类：H1、H2A、H2B、H3、H4和H5。从H1和H2B衍生的序列用于检测系统性红斑狼疮、RA和系统性硬化病中的自体抗体[WO03044054]。即使已知这些蛋白是天然脱亚胺并且通常被修饰[K.Arita等，PNAS2006,103,5291;A.J.W.Zendman等，Anal.Biochem.2007,369,232]，至今没有组蛋白瓜氨酸序列与RA相关。然而，描述用于抗体检测的基于使用经修饰组蛋白（如磷酸化、甲基化、乙酰化和泛素化）但不是瓜氨酸化的微阵列[WO07132177]。

Osborne等[Biochemistry,2007,46(46),13370-13381]描述了在位点17和19有瓜氨酸残基的组蛋白H4片段(1-21)的化学合成以用于酶学研究。