[发明专利]微阵列

说明书

技术领域

本申请涉及用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用的二维和三维微阵列的开发。

具体地，本发明一般涉及样品中的化合物或靶分析物的检测，特别是但不仅是：测定样品中是否存在含特定碱基序列的核酸，定量样品中特定核酸碱基序列的数量，测定具体基因的启动子区域内甲基化的存在和/或程度，和多种因素对核酸甲基化的影响，这些因素包括环境、饮食或药物。

背景技术

多种行业对于检测和鉴定各种靶分析物，包括但不限于分子或蛋白质(包括抗体)的快速、精确且低成本方法的需求日益增长。具体地，对于能(若需要时)由非技术人员无需标准实验环境来进行的测试的需求有所增长。尽管传感器技术是快速扩展的技术领域，仍有多种问题妨碍现场测试和精确检测超越某些灵敏度限度。这些问题包括：读取仪器和/或传感方法的复杂特性，意味着往往需要可观的培训和专门技能；低灵敏度传感技术要求在检测可行前的靶分析物浓缩；需要容纳于实验室中的传感仪器的大尺寸以及相应的非便携特性；对于微生物而言靶物种生长至可测浓度所需的时间；能够发生所研究的反应或结合的表面区域和相应的低表面区域可用性；往往难以进行测量；以及最终对可供所得任意测定参照的参比标准的要求。

核酸(NA)检测和碱基对测定，以及基因启动子区域的甲基化存在或程度的测定都会受益于改进的传感器技术。NA检测和碱基对测定通常需要利用聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)，一种用于将少许拷贝核酸用酶促复制扩增几个数量级的方法。用于分析样品的后续方法取决于样品中的核酸量和该分析所需的细节。因此，这些方法复杂性各异，从简单的电泳凝胶到更复杂的质谱技术，前者给出样品与样品的比较，后者给出下至原子水平的细节。

DNA甲基化是在CpG双核苷酸(DNA中胞嘧啶核苷酸与鸟嘌呤核苷酸通过磷酸二酯键连接的区域)中胞嘧啶的5-碳上共价加成甲基基团。所述共价加成反应由DNA甲基转移酶催化。DNA甲基化通过改变基因表达而不改换DNA序列来影响细胞功能。在细胞分裂过程中，所述改变也可以是可遗传的。

基因的转录要求RNA聚合酶(执行复制过程的酶)与启动子(或表观遗传)区域的连接。基因的启动子区域含有特定的DNA序列和效应元件。启动子区域可含有多簇CpG二核苷酸，其可称作CpG岛或区域。若一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶碱基被甲基化，该启动子区域不再可用，防止所述基因的转录。因此甲基化的启动子区域不能使用，而未甲基化的启动子区域则可以。因此发现DNA甲基化在生物体的发育和正常功能以及疾病的发展中都起到重要作用，也因而成为深入研究的对象。

将DNA与各种条件(例如，疾病、表型等)关联的很多研究着重于DNA甲基化在DNA链的启动子区域中的作用。这是因为已显示表观遗传改变常见于癌症，且通常涉及DNA的甲基化过度和甲基化不足。甲基化过度指CpG区域的甲基化程度增高。其进而导致可遗传的转录沉默，且当肿瘤抑制物基因被沉默时，可导致癌细胞。肿瘤抑制物基因提供编码用于抗增殖信号和负责抑制有丝分裂与细胞生长的蛋白质。相比之下，甲基化不足是指基因组其它区域的甲基化降低。甲基化不足通常发生在正常情况下高度甲基化的重复性DNA中，由于原本被沉默基因表达的活化而导致转录增强和突变率提高。

已发现癌症中的DNA甲基化改变，特别是CpG区域的甲基化过度，发生在癌症发展的相对早期。因此，DNA甲基化可用作检测疾病如癌症的重要生物标记物。此外，由于甲基化后基因序列保存不变，通过甲基化而沉默的个体基因保持完整，因此能通过DNA甲基转移酶的小分子抑制剂来重新活化。

近期研究已表明，启动子区域的甲基化会受多种因素影响，包括饮食和环境因素。通常用质谱来测定甲基化的存在并定量DNA甲基化的变化，但这涉及多个预备步骤(例如，DNA的复制)且昂贵又耗时。

发明目的

本发明的目的是提供二维和三维微阵列用于高灵敏度和选择性的检测/探测应用。本发明的进一步或另一目标是提供测定特定分子或化合物是否存在于样品中和/或以任何方式被修饰的方法。本发明的进一步或另一目标是提供用于测定样品中是否存在包含特定碱基序列的核酸的方法。本发明的进一步或另一目标是使得含特定碱基序列的核酸的检测无需用PCR预浓缩。本发明的进一步或另一目标是提供通过对样品内含特定核酸碱基序列的核酸计数来定量的有用方法。本发明的进一步或另一目标是提供方法来测定基因的启动子区域中甲基化的存在和/或程度，和/或多种因素如环境、饮食或药物对核酸甲基化的影响。本发明的进一步或另一目标是至少为公众提供一种有用选择。

发明内容