[发明专利]具有止血活性的荷有组织因子的富含磷脂的囊泡及其用途

说明书

发明领域

一般来说，本发明涉及使用基于组织因子的促凝血剂治疗受试者中的出血和伤口愈合。更具体而言，本发明涉及包含以微囊泡形式的真核细胞衍生膜和组织因子蛋白质和负电荷磷脂（NCP）的荷有组织因子的微囊泡（荷有TF的微囊泡），以及其作为促凝血剂用于治疗受试者中的出血以及促进血管生成和细胞迁移的应用。本发明进一步涉及用于产生所述荷有TF的微囊泡的方法。

发明背景

止血是生物借助于其响应出血且涉及两个过程的参与的机制，所述两个过程在损伤后立即变得有功能且长时间段保持活性。其中第一个称为初次止血并且特征在于血管性损害部位血管收缩的出现和血小板聚集体形成。第二个称为二次止血，是其中由于不同凝血级联蛋白水解酶作用形成纤维蛋白凝块的时期。

都称为凝血因子的几种辅因子和蛋白水解酶参与血液凝固过程的第二个时期，并且它由几个时期组成，所述时期以来自由于凝血酶作用的纤维蛋白原水解的纤维蛋白形成结束。凝血酶先前通过脱辅基酶凝血酶原的蛋白酶解水解形成。这种蛋白酶解通过活化凝血因子X（FXa）执行，其与活化血小板的表面结合，并且仅在其辅因子活化凝血因子V（FVa）和钙离子的存在下，并且能够水解凝血酶原。凝血因子X（FX）活化可以以两个分开途径――内源性途径和外源性途径出现。

内源性途径由在其中水解每种酶原的一系列反应组成，获得其活性蛋白酶形式。在每个步骤中，新近形成的蛋白水解酶将催化随后酶原的作用，以相继获得活性形式。

在血液凝固外源性途径中，在损害部位处的外膜细胞上表达的组织因子（TF）与循环凝血因子VII/活化凝血因子VII（FVII/FVIIa）结合，以形成TF::FVIIa复合物，并且在钙的存在下，充当底物，从而使得FX活化发生。外源性途径目前认为是血液凝固中的最相关途径，并且公认在通过血管损害产生的出血事件中，由于涉及TF与其配体FVII/FVIIa的相互作用的外源性途径活化而触发凝血。

已广泛公认TF是负责凝血由其起始的快速性的主要元件，并且它是FX活化所需的，这依次开始凝血酶原水解。

已报道了来自多个组织的TF的纯化，例如：人脑，牛脑；人胎盘；绵羊脑；和肺。广泛公认虽然在物种之间的TF蛋白质的结构中存在差异，但如通过体外凝血测定法测量的，不存在功能差异。

广泛公认为了显示生物学活性，TF必须在体外与磷脂结合。已显示例如通过使用磷脂酶去除TF的磷脂组分导致其在体外生物学活性的丧失。

WO2008080989描述包含酵母膜和组织因子蛋白质的荷有组织因子的酵母衍生的微囊泡，及其作为促凝血剂在治疗受试者中的出血中的用途。

WO2006004675描述组织因子在植物细胞中的表达，得自表达TF的植物的粗提取物和包含得自植物细胞的重组TF的人工囊泡。

EP 19359021描述组织因子在昆虫细胞中的表达以及含有在昆虫细胞中表达的重组TF的再脂质化的TF。

然而，本领域存在关于基于TF的另外的促凝剂制备物的需要。

发明概述

在第一个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括

（i）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其变体，

（ii）从步骤（i）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触。

在第二个方面，本发明涉及用于制备具有促凝活性的荷有TF的微囊泡的方法，其包括

（i）提供得自真核细胞的脂质微囊泡，

（ii）在足以将所述TF蛋白质或其变体掺入所述微囊泡内的条件下，使具有促凝活性的TF蛋白质或其变体与如（i）中定义的脂质微囊泡接触，和

（iii）在足以将所述磷脂掺入所述囊泡内的条件下，使步骤（ii）中获得的囊泡与负电荷磷脂接触，

其中步骤（ii）和（iii）可以以任何次序执行。

在另一个方面，本发明涉及使用本发明的方法获得的荷有TF的微囊泡。

在另外一个方面，本发明涉及包含本发明的荷有TF的微囊泡和药学可接受的媒介物的药物组合物。

在另一个方面，本发明涉及包含下述的药物组合物，

（i）通过包括下述步骤的方法获得的微囊泡

a）在真核细胞中表达具有促凝活性的TF或其功能等价变体，和

b）从步骤（a）的细胞中回收荷有TF的微囊泡，

（ii）至少凝血促进剂，和