[发明专利]糖类的分析装置及分析方法

说明书

技术领域

本发明涉及使用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分离分析装置及使用该装置的分离分析方法，特别涉及在将经柱色谱分离的试样溶液与碱性氨基酸一起加热使它们反应的加热器和荧光检测器之间的流路上配置背压发生器的利用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法的还原糖的分离分析装置。

背景技术

还原糖的分析法已知如下的方法:将包含还原糖的试样置于使用含硼酸的水性溶液作为流动相的液相色谱仪中进行洗脱，在流路中，向洗脱液加入含精氨酸等碱性氨基酸的硼酸水溶液，进行加热反应后冷却，向该反应液照射激发光，测定荧光强度或吸光度(专利文献1)。其中使用的装置是将液相色谱仪的流出路延长，将含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给通路与该流路连接，还装有加热装置、冷却装置、激发光的照射装置、及荧光强度等测定装置的装置。在该方法中，必须预先设置用于在来自液相色谱仪的洗脱液加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液使其反应的供给通路。

还有，作为上述方法的改良型已知如下的方法:将包含还原糖的试样置于使用含有硼酸及作为反应试剂的精氨酸等碱性氨基酸的流动相的液相色谱仪中进行洗脱，在流路中，加热洗脱液使反应试剂和还原糖反应(加热反应)后冷却，向该反应液照射激发光，测定荧光强度或吸光度(专利文献2)。在该方法中，由于液相色谱仪的流动相使用含有碱性氨基酸的硼酸水溶液，无需设置用于其后在洗脱液中加入含碱性氨基酸的硼酸水溶液的供给通路。这些还原糖分析法被称为柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法。

上述还原糖分析法都是将还原糖在硼酸存在下与精氨酸等碱性氨基酸经加热反应生成发出强荧光的衍生物的机理利用于从柱洗脱出的还原糖的检测(非专利文献1)。该发荧光衍生物是呈由还原糖与作为氨基化合物的碱性氨基酸的加热反应(美拉德反应)产生的褐色的褐色物质(黑精，melanoidin)，它如果受到作为激发光的波长320nm的光的照射，则放射波长430nm的光。此外，这些还原糖分析法还利用:还原糖具有易与硼酸结合生成阴离子性络离子的性质，及该阴离子性络离子被保持于阴离子交换柱色谱。

柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，流动相使用含有0.01～5%浓度的碱性氨基酸和0.05～0.5M浓度的硼酸的水溶液(pH7～10)。这时使用的碱性氨基酸是精氨酸，赖氨酸，组氨酸等。还已知，最近，作为液相色谱的流动相，使用由0.1M硼酸缓冲液及0.4M硼酸缓冲液构成的梯度进行糖的分离(专利文献3、4)。

柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，液相色谱仪中的试样的洗脱在室温～70℃的温度下进行，此外加热反应(美拉德反应)在140～180℃下进行(专利文献2)。由于洗脱和反应在这样的高温下以高硼酸浓度进行，产生由热引起的流动相的膨胀，在流动相内的对流等。这些现象在柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中会成为由荧光检测器检测的荧光的噪声的原因，进而成为使检测灵敏度降低的原因。因此，利用相同的方法，在进行还原糖的分析，特别是其定量分析时，必须使用专用的软件修正检测结果。

可用柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法分析的还原糖是与碱性氨基酸发生美拉德反应的还原糖，包括葡萄糖、甘露糖、半乳糖、果糖、鼠李糖，岩藻糖等单糖类，麦芽糖、麦芽三糖等低聚糖类，氨基葡萄糖、半乳糖胺等氨基糖类，葡萄糖醛酸等糖醛酸类等。

作为该方法的分析对象，可例举来自于糖蛋白质的糖链的还原糖。构成糖蛋白质的糖链的还原糖有甘露糖、半乳糖、岩藻糖等单糖类，半乳糖胺等氨基糖类等。糖链有时还包含甘露糖-6-磷酸(M6P)。

现有技术文献

专利文献

专利文献1日本专利特开昭58-216953号公报

专利文献2日本专利特开昭61-25059号公报

专利文献3日本专利特开2006-184131号公报

专利文献4日本专利特开2008-245550号公报

非专利文献

非专利文献1 Mikami H.等，Bunseki Kagaku(分析化学)(1983)32，E207

发明内容

在上述背景下，本发明的目的是，除去在柱后荧光检测-硼酸络合物阴离子交换法中，因加热、冷却流路所产生的由荧光检测器检测的荧光的噪声，提高检测灵敏度。