[发明专利]改进的细胞培养基

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术的一般领域，尤其涉及细胞的培养及其在以工业规模生产多肽中的用途。

本发明提供具有高含量氯化胆碱的细胞培养基，其允许以高细胞存活率(viability)培养细胞延长的时间。在用于通过以CHO细胞培养系统重组表达多肽来产生多肽时(尤其是以工业规模来产生多肽时)，本发明的细胞培养基进一步允许获得高多肽生产力和/或改善的产物质量。

背景技术

在过去二十年中，用重组技术制备多肽已发展为标准方法。通过克隆编码各多肽的基因、然后用该待表达的基因转化适宜的表达宿主、最后产生和纯化所获得的重组多肽产物来获得重组多肽提供了一类全新的通过生物学设计和产生的药物。

在重组DNA技术后使用生物工程领域中发展的产生方法，制药产业中已制备了数目越来越多的药物活性化合物。

这类生物产物包括单克隆抗体，其已发展为包括自身免疫病、炎性障碍、免疫抑制、肿瘤学等的多种医学领域中重要的治疗选择。

这类生物来源药物的发展需要以工业规模生产，从而提供大量重组多肽。优选的表达系统是哺乳动物细胞培养物，其优于大多数其他基于昆虫细胞、酵母等的真核系统，或甚至传统的原核表达系统。

但是，尤其是在工业规模，哺乳动物细胞培养包括巨大的挑战。用于哺乳动物细胞培养的生产设施需要彻底优化许多方法条件。

用于控制总体产生方法的最重要的方法参数之一是在其中培养细胞的培养基。适宜的细胞培养基必须为细胞培养物提供所有必需营养物，这在不向培养基中加入动物来源的成分(如血清或蛋白质，例如生长因子)时尤其困难。

另外，哺乳动物细胞培养物在多肽产生方法的不同阶段需要特定的补充成分。因此，细胞培养基必须在以下期间提供必需底物：a)宿主细胞在较低密度下起始生长和增殖；b)随后培养细胞至高密度；c)多肽在培养细胞中形成的实际过程。

用于产生重组多肽的总体方法优选包括扩大期和生产期。在扩大期期间，通过使用生长培养基来将宿主细胞培养至高密度，以最大化随后的多肽产生。在生产期期间，通过使用生产培养基来达到希望的多肽的大量的实际形成。为了满足细胞在总体多肽产生方法的各阶段中的具体的代谢需要，分别为扩大期和生产期设计了不同的培养基组合物。例如，生产培养基通常包含量比生长培养基高的氨基酸。

因此，过去已进行了大量的努力来研发特别强调它们在多肽的大规模产生中的用途的细胞培养基。然而，细胞培养基的持续改进仍然是重要目标，以进一步就产物质量和数量产率最大化多肽产生。

过去已就其在多肽产生中的作用研究了细胞培养基的许多成分。可能的靶标是无机盐、氨基酸、碳源(如葡萄糖)或维生素。

例如，已显示补充如维生素、氯化胆碱或氨基酸的化合物可以增加在无蛋白质条件下培养的细胞的存活率和生产力(Kim do Y等，Cytotechnology 2005，47，37-49)。

氯化胆碱是细胞培养基的标准成分，其作为细胞的磷脂前体。被细胞摄取并加工后，它作为细胞膜中除磷脂酰乙醇胺和磷脂酰肌醇外的称为磷脂酰胆碱的主要磷脂之一终止。

如D-MEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium)和D-MEM/F-12的常用细胞培养基已广泛用于培养广范围的哺乳动物细胞系。这些培养基分别包含4mg/L和8.98mg/L的氯化胆碱量。

其他市售培养基，如Ham’s F-12(可从BioConcept购得)和MEM(可从HyClone购得)也分别包含13.96mg/L和56mg/L的低量氯化胆碱。

US 6,180,401公开了改进的用于在动物细胞培养物中产生多肽的方法。一个目标是增加终产物浓度。修改了包括葡萄糖浓度、重量摩尔渗透压浓度(osmolality)和谷氨酰胺浓度的几个参数来最大化生产期中的产物产率。US 6,180,401公开了具有50.86mg/L的氯化胆碱含量的细胞培养基。

US 5,122,469公开了用于繁殖多种哺乳动物细胞系，尤其是中国仓鼠卵巢细胞(CHO)的培养基，其允许以适合用于哺乳动物细胞的小规模和大规模繁殖的单层或悬浮形式高密度培养细胞。另一个优势是增强的产物产率。该培养基是包含提高水平的某些氨基酸的化学成分确知培养基。氯化胆碱含量是50.86mg/L。