[发明专利]荧光显微镜载玻片

说明书

相关申请的参考

本申请要求美国临时专利申请No.61/336,115(2010年1月15日提交)的优先权。

简述

本教导涉及用于增加找到焦点区域(field of focus)的效率以及增加在利用荧光显微技术读取载玻片(slide)时视场的准确性的设备和方法。

结核病(TB)成为了全球性的健康问题。估计世界人口的三分之一感染了TB致病媒介，结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。在大部分情况中，疾病保持潜伏状态，大约5至10%的受感染人群在他们生命中的一定时期将继续发展成为活动性疾病。剩下的是未被发现的和/或未治疗的，患者死亡率为大约50%。另外，统计分析显示未治疗的受感染个体每年将继续感染10至15个其他个体。

至少从1990开始(其中在1990时世界卫生组织开始追踪发生率数据)，世界范围内的活动性TB的发生率呈增加趋势。评估显示了如果当前全球TB状况不改善，则到2020年将会有一亿五千万人发展为活动性结核病以及三千六百万人将死亡。全球TB问题由于增加的HIV流行病而进一步恶化。患有HIV的人感染了结核分枝杆菌，则发展为活动性TB的风险增加。事实上，TB是感染了HIV个体的第一死亡原因。

减小这个疾病的发生率是全球优先的且是2000年发布的联合国千年发展目标的主要部分。为了实现这些目标，世界卫生组织(WHO)已经开发了STOP TB策略，该策略是用于减小全球TB负担的多方位方法。该策略的关键是通过高质量保证的细菌学来检测病例。特别地，已经制定了大于70%的涂阳(smear positive)病例检测的全球目标。

在长达一世纪的时间内，TB检测的重要手段是痰涂片明视野显微镜且其仍是全球范围内最常用的病例检测技术。普遍使用该技术的原因部分是因为该方法所需的资源相对较少。这对于发展中国家是尤其重要的，相对工业化国家，发展中国家TB(和HIV)感染的形势严峻。虽然明视野显微镜在TB健康方面起作用，但是其灵敏度较低，约为60%。在HIV流行程度高的情况中，该方法灵敏度显著降低，这是因为经常发现HIV患者中的杆菌负荷小。此外，在化验体积(assay volume)高的实验室中，检查时间可能减小，导致灵敏度进一步损失。

当前最常使用的明视野痰涂片染色技术是齐-尼氏(ZN)方法，该方法使用品红染剂(fuschin stain)、酸-醇脱色剂以及亚甲基蓝复染剂。该染色方法和其他染色方法利用结核分枝杆菌和其他分枝杆菌类(一起被称为抗酸杆菌(acid fast bacilli)(AFB))的“耐酸性”的优势。在这些方法中，AFB吸收染色但是具有酸脱色抗性，而一般的呼吸道菌群和碎片退色。ZN染色导致AFB相对蓝色背景被染为红紫色。通过该技术以及利用其他明视野方法，较难从背景材料中鉴别和区分杆菌，且熟练技术人员需要较长的时间进行适当检查。在很多TB实验室设置中时间和熟练技术人员通常是有限的。

基于上述，最广泛使用的检测结核病的测试是利用来自标准光学显微镜的白光进行明视野显微镜分析。用于该检测的标准观察倍数是1000倍。但是，由于细菌的形态是独特的以及具有大量区别特征，以及由于上述的ZN染色困难，需要相当熟练的技术员和/或实验室专家来检测结核病。另外，明视野显微镜的标准的和当前可接受的测试参数需要一百个以1000倍的倍数的分离的观察“场”来进行诊断。该方法是特别耗时的以及限制显微镜技术人员或技术员在给定的时间内可以准确读取的载玻片数目。相应地，对显微镜技术人员的需求比当前可支配的显微镜技术人员显著更大。在世界上的一部分地区确实如所述，在这些地区中，结核病测试是重要的且是需要的，包括非洲和亚洲。

还显示荧光显微镜(FM)可用于检测AFB。FM技术利用荧光染料例如金胺-O，以及还使用一些形式的脱色剂和淬灭剂。通过FM，AFB染色(AFBstain)从绿色变为黄色，背景为暗色背景，从而相比较明视野方法而言，使得生物体和背景之间存在显著差别。该差别的增加减小了眼睛压力且允许使用具有更大视场的物镜，从而减小总检查时间。总体来说，相比较标准明视野显微镜而言，证实了基于FM的TB检测提供更高的灵敏度以及更短的检查时间。基于这些优势以及新型发光二极管(LED)荧光显微镜的可获得性，世界卫生组织积极促进利用荧光显微镜来诊断结核病的全球化。