[发明专利]BMP-2亲和肽

说明书

技术领域

本发明涉及骨形态发生蛋白-2(BMP-2)的特异性亲和肽。另外，本发明涉及这些亲和肽在BMP-2控释装置中的应用。

背景技术

BMP-2是一种属于称为转化生长因子β(TGF-β)的超家族的蛋白质。已知BMP-2可诱导骨和软骨的形成。例如，BMP-2已被用于通过手术植入与该蛋白质组合的胶原基质来促进骨修复。BMP-2以水性悬浮液的形式加载到可吸收的胶原海绵中。BMP-2与胶原非特异性地缔合。然而，由于胶原原纤维对BMP-2的低结合能力(反之亦然)，BMP-2可能会从胶原基质渗漏出去。BMP-2从胶原海绵的这种渗漏会导致在植入部位或其附近出现不良的旺盛骨形成和/或异位骨形成。不良的骨骼生长会引起进一步的并发症，导致病人需要一项或多项额外矫正手术。

因此，需要一种BMP-2控释装置来消除在不希望的位置的骨形成的问题性副作用。制备控释装置的标准方法包括使用聚合物基质，通常为微球、棒、片或丸的形式，其用于封装活性剂。已知有多种技术可将活性剂掺入到聚合物基质中。例子包括对具有离散性(discrete)大小或形状的颗粒的溶剂蒸发、喷雾干燥、乳化、熔融共混和简单物理混合。由于肽或蛋白质的微妙性质，这些方法均不可应用于将这些分子掺入到聚合物中。肽和蛋白质容易因为溶剂、乳化、高温和(尤其是)最终灭菌而变性。

因此，需要一种制备BMP-2控释装置的方法，并且该方法不会使蛋白质变性或失去活性。还期望一种能提供蛋白质的局部持续释放从而避免不期望的异位骨形成的BMP-2控释装置。

发明内容

本文描述了BMP-2亲和肽。这些亲和肽对BMP-2具有特异性亲和力，可用于制备亲和生物基质。还描述了BMP-2控释装置，其由亲和生物基质和BMP-2制备而成。

附图说明

图1.对BMP-2具有特异性亲和力的氨基酸序列(亲和肽)，其包含线性肽和受二硫键约束的肽。

图2.控释装置的图形表示，其包含亲和生物基质和BMP-2。

图3.BMP-2噬菌体ELISA测定证实了从噬菌体选择产生的噬菌体展示肽结合到BMP-2。

图4A.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出最小交叉反应的结合噬菌体。

图4B.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出高度交叉反应的结合噬菌体。

图4C.用递增的噬菌体数目/孔进行的验证性和交叉反应性噬菌体ELISA测定，显示出在高噬菌体浓度(10¹⁰个噬菌体/孔)下交叉反应的结合噬菌体。

图5A.对人IgG的交叉反应性噬菌体ELISA测定。

图5B.对人血清白蛋白(HSA)的交叉反应性噬菌体ELISA测定。

图6.亲和肽与BMP-2的浓度依赖性结合，采用放大发光接近均匀测定法(amplified luminescent proximity homogenous assay，ALPHA)。

图7.通过评估在存在BMP-2的情况下3天后小鼠(MCH 1/26)成骨细胞的碱性磷酸酶活性得出的亲和肽对BMP-2受体结合的功能干扰。

图8A.用于将SEQ ID NO：6缀合到包含乙酰化N端和接头的胶原基质的肽的氨基酸序列(SEQ ID NO：23)。

图8B.耦联了SEQ ID NO：23后的胶原亲和生物基质的扫描电子显微镜(SEM)图象。

图9.加载到胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘中的BMP-2的掺入百分比。

图10.体外释放研究，示出在36天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。

图11A.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO：3片段。

图11B.突变型噬菌体ELISA，示出结合到BMP-2的SEQ ID NO：6片段。

图12.用于鉴定结合到BMP-2的SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：6片段的氨基酸序列，以及结合到BMP-2的片段的氨基酸序列。

图13.体外释放研究，在包含2％热灭活的胎牛血清(FBS)的磷酸缓冲盐水(PBS)中进行，示出在15天时间里从胶原生物基质及胶原亲和生物基质盘释放的BMP-2的量。

图14.用于体内笼状植入物测试系统的不锈钢腔室的图象。