[发明专利]靶向基因组改造

权利要求书

1.一种分离的核酸，其包含用于一对或多对锌指核酸酶的多个成对靶点。

2.根据权利要求1所述的核酸分子，其中来自各成对靶点的一个靶点包含相同的序列。

3.根据权利要求1或2所述的核酸分子，其进一步包含一种或多种编码序列。

4.一种细胞或细胞系，其包含根据权利要求1-3中任一项的核酸分子。

5.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞是真核细胞，诸如植物细胞或哺乳动物细胞或哺乳动物细胞系。

6.根据权利要求4或权利要求5所述的细胞，其中所述核酸分子被整合进入所述细胞的基因组。

7.一种用于将一种或多种外源序列整合进入细胞基因组的方法，所述方法包括

(a)向根据权利要求6的细胞中提供一对或多对锌指核酸酶，其中所述锌指核酸酶结合于所述被整合核酸分子中的靶点，从而使所述核酸酶与其靶点的结合切割了所述细胞的基因组，以及

(b)将所述细胞接触包含外源序列的多核苷酸，其中所述外源序列被整合于细胞的基因组中所述被整合的核酸内。

8.根据权利要求7所述的方法，其进一步包含使用另外的锌指核酸酶对步骤(a)和(b)的重复，所述锌指核酸酶在另外的外源序列存在的情况下切割所述整合的核酸分子中另外的靶点，由此将所述另外的外源序列插入所述细胞的基因组中。

9.根据权利要求8所述的方法，其中一种或多种所述外源序列包含锌指核酸酶的一种或多种靶点。

10.根据权利要求9所述的方法，其中所述靶点是锌指核酸酶半靶点，其中通过所述半靶点的整合创建了靶点。

11.根据权利要求7至10中任一项所述的方法，其中一种或多种所述外源序列包含编码序列并且所述细胞表达所述编码序列的产物。

12.一种用于使插入细胞基因组中的一个或多个序列缺失的方法，所述方法包括：

(a)对根据权利要求7至11中任一项的多种外源序列进行整合；以及

(b)在所述细胞中表达所述适当的核酸酶，从而将一种或多种所述外源序列从所述基因组中缺失。

13.一种提供基因组改造的细胞的方法，所述方法包括

(a)根据权利要求7至12中任一项所述的方法在至少第一种细胞中整合或缺失一种或多种外源序列：

(b)使所述第一种细胞发育成为性成熟的生物体；以及

(c)将所述生物体与包含基因组改造的第二种生物体进行杂交以产生第二种细胞，所述第二种细胞具有所述第一种和第二种生物体的至少一种基因组改造。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述第二种细胞基因组改造在所述第二种细胞中单一基因组位置包含多种异源基因。

15.根据权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所述细胞在包含所述被整合的核酸分子的区域外进一步包含对其基因组的修饰。

16.根据权利要求7至14中任一项所述的方法，其中所述细胞是植物细胞。