[发明专利]新颖的β-葡萄糖苷酶及其用途

说明书

相关申请的交叉引用

本申请主张享有2010年1月28日递交的美国临时申请No.61/299,007的优先权。在此通过引用该申请的全部内容将其引入本文。

背景技术

替代性能源的发展（如，太阳能、生物燃料、水力、风力等），多年来一直受到大力提倡，以解决因大量消耗化石燃料而产生的日渐严重的能源问题。在诸多可能的能源中，植物生质是特别受到关注的，因其为可再生性。植物体含有高量的纤维素，其为制造生物燃料的一种起始材料。为了将纤维素转化为生物燃料，其首先需由微生物的纤维素水解系统降解为可发酵糖，诸如纤维二糖及葡萄糖。此种系统包括三种主要类型的水解酶，亦即，内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)、外切葡聚糖酶(EC 3.2.1.91)及β-葡萄糖苷酶(EC 3.2.1.21)。尽管已由各种微生物中分离出诸多葡萄糖苷酶，其效能皆不令人满意。因此，仍需要具有高效能的葡萄糖苷酶。

发明内容

本发明涉及一种新颖的葡萄糖苷酶，BGL-Cr-D2，其分离自台湾原生种的真菌刺孢壳叶斑菌(Chaetomella raphigera)。图2所示为该成熟BGL-Cr-D2蛋白的序列(722个氨基酸残基/SEQ ID NO:1)、对应的bgl-Cr-D2cDNA(2166bps/SEQ ID NO:2)、其信号肽序列(SEQ ID NO:7)、对应的cDNA(SEQ ID NO:8)、BGL-Cr-D2蛋白与其信号肽(SEQ ID NO:4)、以及对应的cDNA(SEQ ID NO:5)。图1所示为刺孢壳叶斑菌中编码该BGL-Cr-D2酶的基因组DNA区域(2851bps,SEQ ID NO:3)，其含有12个内含子节段，而该基因组DNA区域对应SEQ ID NO:4(SEQ ID NO:6)。

因此，本发明的一个方面表征为一种分离的多肽，其含有与SEQ ID NO:1具有由BLAST算法所测定的至少70%(如，80%、90%、95%、或99%)氨基酸同一性的序列。在一实例中，该多肽具有β-葡萄糖苷酶活性。

本发明亦涵括(i)一种分离的核酸，其包括编码上述多肽的核苷酸序列，以及(ii)一种宿主细胞，其含有该种分离的核酸。在一实例中，该核苷酸序列含有SEQ ID NO:2、3、5或6的序列。本发明的分离核酸可为表达载体，其中该核苷酸序列以可操作的方式连接适当的启动子序列（亦即，可在宿主细胞中起始转录的序列）。

术语「分离的多肽」或「分离的核酸」在本文中指一多肽或核酸，其实质上不含天然相关的分子，亦即，该些天然相关的分子构成含有该多肽或核酸的制备物的最多20%干重。纯度可以任何适当的方法测量，如，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳及HPLC。

本发明的范围中也包括(A)一种组合物，其含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶、及β-葡萄糖苷酶，以及(B)一种由木质纤维素物质制备可发酵糖的方法。该方法包括(i)提供上述的组合物，以及(ii)使此组合物与木质纤维素物质接触以制备可发酵糖，如，葡萄糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖、鼠李糖、蔗糖、果糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、或纤维二糖。该可发酵糖可通过微生物发酵或酶的处理而转化成为发酵产物，诸如醇。用于此方法中的木质纤维素物质的实例包括，但不限于，果园剪枝、树丛、工厂废材、城市废木料、城市废弃物、伐木废弃物、森林疏伐、短轮伐期木质作物、工业废弃物、小麦、麦杆、燕麦杆、稻草、大麦杆、裸麦杆、亚麻茎、黄豆壳、稻壳、燕麦壳、甘蔗、玉米、玉米穗轴、玉米杆、玉米麸饲料、玉米芯、玉米皮、玉米粒、取自核仁的纤维、草原的草、鸭茅状磨擦禾、狐尾草、甜菜渣、柑橘类水果渣、种壳、纤维素质动物粪便、草坪修剪物、棉花、海草、树木、灌木、草、甘蔗渣、谷物的湿或干磨的产物及副产物、城市固体废弃物、废纸、庭院废弃物、草本材料、农业废弃物、林业废弃物、城市固体废弃物、废纸、纸浆、造纸厂废材、枝条、灌木、甘蔗、玉米、玉米皮、能源作物、森林、水果、花、谷粒、草、草本作物、叶、树皮、针状叶、圆木材、根、树苗、灌木、柳枝稷、树木、蔬菜、果皮、藤蔓、甜菜渣、小麦粉头、燕麦壳、硬及软木、由农业流程产生的有机废弃物质、林业废木，或其组合。如该发酵产物是可燃性的，该方法进一步包含燃烧该可燃性发酵产物以产生能量的步骤。

本发明亦提供一种生物反应器，其含有木质纤维素物质以及一种组合物，该组合物含有上述的多肽、外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和/或β-葡萄糖苷酶。