[发明专利]一种DNA序列、干扰RNA及其在防治害虫中的应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种DNA序列和使其基因沉默的干扰RNA，以及在防治害虫中的应用。

背景技术

农业害虫危害是我国农业产量的重要制约因素，长期施用化学杀虫剂导致一系列问题：1)昆虫出现抗药性，用药剂量加大，防治成本提高；2)农药残留导致环境污染严重；3)对非靶标生物有较大影响。现有生物杀虫剂在害虫防治中应用较广，但杀虫效果缓慢。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)分子在mRNA水平关闭相应序列基因表达或使其沉默的过程。dsRNA可以抑制不同类型细胞的靶向基因表达，用特异性的抗体几乎检测不到靶向基因所表达的蛋白质。因此，RNAi技术又被形象地称为基因敲除或基因沉默。RNAi的发现是基因的功能研究方法学的重大突破。2007年“Nature Biotechnology”杂志先后两篇论文表明能够表达靶向害虫的重要致死基因V ATPase A，CYP6AEl4 and GSTI的dsRNA转基因植物可以控制病虫害的发生，是害虫防治的新方法(Baum et a1，2007；Mao et al，2007)。2008年，Price和Gatehouse提出了基于RNAi的害虫防治策略，该策略有如下优势：1)选择对害虫专一的基因进行干扰，对高等动物和人类是安全的：2)抗虫具有专一性，对非靶标生物不具有杀伤性；2)对环境无毒无害。

广泛用于昆虫RNAi实验的基本方法有两种。一种方法是采用体外合成的dsRNA，然后将其导入昆虫体内或细胞中，称为外源性RNAi；另一种方法是用DNA表达载体导入昆虫体内或细胞中，在体内或细胞中表达时合成dsRNA，称为内源性RNAi。尽管内源性方法可以在昆虫生活史的任何时间实现细胞特异性或组织特异性的RNAi，具有遗传性等优点，但由于很多昆虫还没有建立成功的转基因体系，所以这种方法目前还并不适合许多昆虫的基因功能研究。因此外源性RNAi是目前研究的重点手段。而实现基于RNA干扰进行害虫有效控制的关键则是筛选对昆虫高效致死的干扰RNA。

目前利用RNA干扰技术杀灭害虫的研究虽然有一定的进展，但能够实现对害虫进行有效杀灭的靶点仍然十分稀少且效果仍难以令人满意，例如昆虫蜕皮基因是目前研究较多的一个靶点，利用对该基因的干扰可以实现杀灭昆虫，但是对该基因的干扰必须是在昆虫蜕皮前四天进行，因此对时间的要求较高，从而使得实验实施起来较为复杂（Zhang, Yin et al，2007）。

酚氧化酶原激活系统（prophenoloxidase activated system, proPGAS）在参与无脊椎动物的黑化防御反应中起着重要作用。β-1,3-葡聚糖识别蛋白(β-1,3-glucan-recognition protein, βGRP)是一种重要的真菌模式识别受体，它主要参与识别真菌细胞壁成分β-1,3-葡聚糖，进而激活酚氧化酶（phenoloxidase, PO）的酶原形式，即酚氧化酶原（prophenoloxidase, PPO）存在，无活性的PPO在丝氨酸型蛋白酶作用下被激活转变成具有活性的PO，进而将体内多巴胺催化生成黑色素并最终实现生物体的黑化防御反应。黑化防御反应伴随着动物的一生。β-1,3-葡聚糖识别蛋白参与识别真菌细胞壁成分,在活化酚氧化酶原激活系统中具有关键作用，因此采用RNAi技术，开展β-1,3-葡聚糖识别蛋白dsRNA在害虫防治中的作用具有重要意义。

发明内容

本发明的目的在于提供一种DNA序列，可编码β-1,3-葡聚糖识别蛋白。

本发明的另一目的在于提供用于沉默上述DNA序列的干扰RNA。

本发明的另一目的在于提供一种防治害虫的方法。

本发明的目的是通过如下措施实现的。

一种DNA序列，它具有序列表中SEQ ID NO:1所述的碱基序列或对SEQ ID NO:1所示碱基序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列。

一种DNA序列，它具有能在高度严格条件下与SEQ ID NO:1所示碱基序列或对SEQ ID NO:1所示核苷酸序列进行一个或多个核酸的取代、缺失或添加所获得的，具有与SEQ ID NO:1相同功能的碱基序列杂交的碱基序列。

上述DNA序列，来源于昆虫纲。优选地，上述DNA序列，来源于蝗虫。更优选地，上述DNA序列，来源于东亚飞蝗。